以壳聚糖为载体束缚脂肪酸吸附CO2在诱捕白纹伊蚊中的应用研究

吴 华,戴建青,陈大嵩,黄 鸿,杨琼芳

(广东省科学院动物研究所,广东省动物保护与资源利用重点实验室,广东省野生动物保护与利用公共实验室,广东省矿物油农药工程技术研究中心,广州 510260)

白纹伊蚊Aedesalbopictus在我国最适宜的分布区在北纬30°以南,是登革热、黄热病以及西马脑炎等多种虫媒疾病的传播媒介(陆宝麟和赵彤言,2000)。蚊虫的吸血、宿主搜寻等行为主要受宿主动物气味物质的影响(Gibson and Torr,1999;Takken and Knols,1999)。据文献报道,人体引诱蚊虫的差异与人体汗液有关,汗液参与影响蚊虫宿主搜寻行为,人体汗液的主要成分是脂肪酸类物质(Boschetal.,2000)。吴华(2020a;2020b;2021a;2022)报道了乙酸、丙酸、丙酮酸等脂肪酸不仅对白纹伊蚊有吸引力,还对致倦库蚊Culexpipiensquinquefasciatus有吸引力。此外,人体呼出的二氧化碳(CO2)是公认的对蚊虫具有极佳吸引力的物质(李剑泉等,2003;Meerausetal.,2008;Farajollahietal.,2009;Obenaueretal.,2009;Johnsonetal.,2012)。

离子液体(Ionic liquid, IL)是由阴阳离子组成的低温融盐,具有蒸气压低、稳定性好、液程宽、气体吸收性能好、可设计性等特点(Welton,1999;Hallett and Welton,2011)。因此,离子液体在吸附CO2方面具有广泛应用(Wangetal.,2011;阳涛等,2012;刘维伟等,2012;Luoetal.,2014;李桂花等,2015)。壳聚糖结构单元中存在-NH2基团,极易与酸反应成盐,壳聚糖可以溶解在脂肪酸中,形成一种脂肪酸型离子液体。

本研究以壳聚糖为载体束缚脂肪酸(丙酮酸、乙酸、丙酸),形成壳聚糖+脂肪酸离子液体,达到吸附、储存、缓释CO2的目的,并进行诱蚊试验,以期研制出具有较佳诱蚊效果的组合物。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1试剂与仪器

壳聚糖,脱乙酰度≥95%,粘度100～200 mPa.s,丙酸,99.5%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;丙酮酸,96%,乙酸,99.5%,上海吉至生化科技有限公司;二氧化碳(CO2),99.99%,干冰(固态二氧化碳),密度(固态):1 560 kg/m3(-78℃),广州盈新气体有限公司。

Secura224-1CN分析天平,精度:0.1 mg,德国赛多利斯集团;HH-501S循环水浴锅,金坛区金城春兰实验仪器厂。

1.1.2离子液体配制

将等物质的量的脂肪酸(丙酮酸25 g、乙酸17 g、丙酸21 g)加入到1 g壳聚糖中,在室温下充分搅拌12 h。得到壳聚糖+丙酮酸、壳聚糖+乙酸、壳聚糖+丙酸离子液体。

1.1.3引诱剂的配制

将60 mL/min的CO2分别通入壳聚糖+丙酮酸、壳聚糖+乙酸、壳聚糖+丙酸离子液体中,边搅拌边吸收30 min,得到(壳聚糖+丙酮酸+CO2)、(壳聚糖+乙酸+CO2)、(壳聚糖+丙酸+CO2)诱蚊组合物。将(壳聚糖+丙酮酸+CO2)、(壳聚糖+乙酸+CO2)、(壳聚糖+丙酸+CO2)、(壳聚糖+丙酮酸)、(壳聚糖+乙酸)、(壳聚糖+丙酸)、丙酮酸、乙酸、丙酸各称取2 g,滴在医用脱脂棉上;干冰,现场称取2 g,放在医用脱脂棉上;壳聚糖,称取2 g;纯水500 g,备用。

1.1.4陷阱诱捕器的制作

陷阱诱捕器:8 L方形黑色塑料桶(高26 cm,上长:24 cm,上宽:16 cm,下长:20 cm,下宽:13.5 cm)购自市场,将其内部不留死角全面涂一层胶黏剂。试验过程中,以陷阱诱捕器中不加试验物,只加纯水作为对照组。

1.1.5试验场所

以广东省科学院动物研究所大院作为试验场所。大院内树木以红花羊蹄甲、木棉树、芒果树、白玉兰、莲雾树和大叶榕树为主;建筑物周围的绿化带则主要种植花叶合果芋和翠芦莉;围墙外有池塘竹林,环境适合蚊虫滋生。

1.2 试验设计

1.2.1CO2吸收试验

参考陈凯宏等(2016)的重量法,取约1 g的壳聚糖+脂肪酸离子液体放入直径为10 mm的玻璃瓶中,将玻璃瓶置于金属加热套管中恒温,金属加热套管固定于25℃恒温水浴锅中,边搅拌边将60 mL/min的CO2通入离子液体中,每隔一定时间用精度为0.1 mg的电子天平称重,通过重量法得到离子液体吸收CO2的量。

1.2.2不同化合物对白纹伊蚊的引诱作用

处理组:按上述1.1.3方法,将处理过的脱脂棉放入按1.1.4制作的陷阱诱捕器中,每隔3周换1次。对照组(纯水):在1.1.4制作的陷阱诱捕器里加入500 g纯水,形成小积水,每隔3周换1次。试验设置5个区组,每个区组内陷阱诱捕器的间距大约为3.0 m。试验过程中,每天调查白纹伊蚊诱捕数量并清除捕获的个体。陷阱诱捕器的位置每调查5次重新随机变化1次。

1.2.3不同化合物对白纹伊蚊诱捕的持效性

将1.2.2试验获得的对白纹伊蚊具有增效作用的混合物及其单组分化合物,通过延长观察时间,观察各化合物对白纹伊蚊诱捕的持效时长。试验方法同1.2.2,试验过程中,处理组不更换诱芯脱脂棉。

1.3 数据处理与统计分析

每个阶段的试验结束后,将不同日期同一配方的5个陷阱诱蚊装置分别对其诱捕量进行加和,以计算该配方的累计诱捕量;除以该配方重复次数(n=5),即为平均累计诱捕量(忻伟隆等,2015)。应用SPSS 24.0软件,对试验数据进行比较平均值分析,单因素ANOVA检验,事后多重比较(R-E-G-W范围)处理,P< 0.05为差异具有有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 CO2吸收结果

脂肪酸型离子液体在25℃,常压下吸收CO2的结果见表1。吸收CO2性能最好的是壳聚糖+丙酮酸离子液体,1 mol壳聚糖+丙酮酸可以吸收0.0290 mol CO2,吸收CO2性能比壳聚糖+乙酸(0.0172 mol)和壳聚糖+丙酸(0.0183 mol)强,后两者性能差别不大。

表1 25℃常压条件下脂肪酸型离子液体的CO2吸收结果

2.2 不同化合物对白纹伊蚊的引诱作用

在供试的10种化合物中,对白纹伊蚊的平均累计诱蚊量均显著高于对照纯水(P<0.05),壳聚糖无诱蚊活性(P>0.05)。吸附CO2的脂肪酸(丙酮酸、乙酸、丙酸)均显著高于单组分脂肪酸(丙酮酸、乙酸、丙酸)(P<0.05),说明CO2对脂肪酸具有协同增效作用。其中壳聚糖∶丙酮酸∶CO2=1∶25∶0.3621配比的平均累计诱蚊量最高,达26.80±1.30头,其次是壳聚糖∶乙酸∶CO2=1∶17∶0.2141配比23.40±4.04头和壳聚糖∶丙酸∶CO2=1∶21∶0.2280配比23.20±3.83头,极显著高于对照纯水6.80±0.84头(P<0.05)。壳聚糖对脂肪酸(丙酮酸、乙酸、丙酸)无增效作用,其平均累计诱蚊量与单组分脂肪酸(丙酮酸、乙酸、丙酸)比较,差异不显著(P>0.05)。同剂量下3种脂肪酸吸附CO2对白纹伊蚊的诱蚊效果依次是丙酮酸>乙酸=丙酸(表2)。

表2 不同化合物对白纹伊蚊的引诱作用

2.3 不同化合物对白纹伊蚊诱捕的持效性比较

供试化合物对白纹伊蚊诱捕的持效性与化合物的挥发性有关,干冰CO2的挥发性最强,5 d内即挥发完了,表现为5 d后诱捕蚊虫数量低于对照纯水。然后是乙酸和丙酸,约20 d后诱捕蚊虫数量低于对照纯水。丙酮酸挥发性较弱,35 d后诱捕蚊虫数量才与对照纯水相当。壳聚糖对挥发性的脂肪酸(丙酮酸、乙酸、丙酸)均有缓释作用,60 d的累计诱蚊总数量是单组分脂肪酸的1.46～2.43倍,持效期延长1.71～3.00倍。以壳聚糖为载体束缚脂肪酸(丙酮酸、乙酸、丙酸)吸附CO2(壳聚糖+脂肪酸+CO2)在60 d内的诱蚊量均高于(壳聚糖+脂肪酸),(壳聚糖+脂肪酸+CO2)混合物的60 d累计诱蚊总数量是(壳聚糖+脂肪酸)的1.62～1.78倍,这说明CO2对脂肪酸(丙酮酸、乙酸、丙酸)具有协同增效作用(图1)。

图1 不同化合物对白纹伊蚊诱捕的持效性Fig.1 Comparison of persistence of different compounds in the trapping of Aedes albopictus

3 结论与讨论

赵锦年等(2011)利用微晶碳素、膨润土等缓释材料来改善松褐天牛Monochamusalternatus引诱剂的释放速率,改良后的引诱剂持效期延长了4倍。吴华(2021a)通过乙酸铵对乙酸的吸附缓释作用,制成的缓释型白纹伊蚊引诱剂,释放速率稳定,持效期长,混合物的累计诱蚊总数量(60 d)是单组分乙酸的3.46倍。根据离子液体原理,本研究选择以壳聚糖为载体束缚具有诱蚊活性的脂肪酸(丙酮酸、乙酸、丙酸),壳聚糖与脂肪酸形成铵盐结构,释放速率稳定,持效时间长,壳聚糖+脂肪酸离子液体60 d的累计诱蚊总数量是单组分脂肪酸的1.46～2.43倍,持效期延长1.71～3.00倍。说明可以根据离子液体原理,改善引诱剂的挥发性,使其释放速率稳定,延长持效期。

蚊虫的嗅觉感受器多分布于其触角、触须与尾感器上,研究表明对CO2的感受器分布在触须上,而其他化合物的感受器则分布在触角和尾感器上(郝蕙玲,2009)。蚊虫通过下颚须(嘴边一种微小的附器)测出CO2,因为下颚须上有对CO2反应灵敏的气味感受器,故蚊虫可以远距离定位宿主。蚊虫定位宿主是人体不同气味物质协同作用的结果(Geieretal.,1999)。本研究中,乙酸、丙酸是人体汗液成分,CO2是呼气成分,丙酮酸是体内产生的三碳酮酸,它是糖酵解途径的最终产物(王翔等,2002),也是人体气味之一。以壳聚糖为载体束缚脂肪酸(丙酮酸、乙酸、丙酸)吸附CO2作为诱蚊组合物,现场诱蚊效果显示,吸附CO2的脂肪酸(丙酮酸、乙酸、丙酸)均显著高于单组分脂肪酸(丙酮酸、乙酸、丙酸)(P<0.05),说明触须感受器的CO2与触角和尾感器感受器的脂肪酸具有协同增效作用,CO2主要发挥远距离引诱作用。吸附CO2的组合物(壳聚糖+脂肪酸+CO2)60 d的累计诱蚊总数量是不吸附CO2的组合物(壳聚糖+脂肪酸)的1.62～1.78倍。

壳聚糖+脂肪酸离子液体可以吸附CO2,起到缓释作用,可根据其脂肪酸味道选择适用环境,丙酮酸及混合物味道不大,可适用于家居办公环境中使用,乙酸、丙酸味道太大,可在野外使用。