光谱技术结合化学计量学分析方法快速检测阿维菌素的试验研究

李艳芬，马瑞峻，陈瑜，黄丽，颜振锋，蔡祥

（华南农业大学工程学院，广州 510642）

目前，水稻中常用的农药有三唑磷、辛硫磷、阿维菌素、三氟苯嘧啶、四氯虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、茚虫威、呋虫胺、烯啶虫胺等，这些农药当中有机磷农药三唑磷[1]、辛硫磷[2]和生物农药阿维菌素[3]对水生生物的毒性比较高，其他农药对水生生物的毒性都比较低。阿维菌素在防治水稻螟虫、稻纵卷叶螟（目前对水稻危害最大的害虫之一）方面表现优异，因此具有较高的研究价值。

阿维菌素（Avermectin）是由日本和美国首先开发的由土壤微生物阿维链霉（Strentomyces avermitilis）发酵产生的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物[4]，其化学式为C48H72O14（B1a）·C47H70O14（B1b），分子结构如图1 所示。市售阿维菌素活性物质是avermectinB1a+B1b，其中B1a≥90%、B1b≤5%，以B1a的含量来标定，阿维菌素是防治水稻害虫理想的生物农药[5]。目前对于水体中阿维菌素农药的检测最常用且最准确的方式是液相色谱法[6]，包括高效液相色谱紫外检测法（HPLC-UV）、高效液相色谱荧光检测法（HPLC-FLD）等，该方法具有检测限低、重复性高的优势，但其检测样品多集中在蔬菜、水果、脂肪、肉类等方面，且其检测设备价格高且大型，需要专业维护，预处理繁琐耗时，检测时需严谨操作，依赖性强，只能用于实验室检测，无法实现现场快速检测[7]。因此，寻找一种现场快速、准确、经济的方法用于检测水体中阿维菌素具有重要的实际意义。

图1 阿维菌素分子结构Figure 1 Molecular structure of avermectin

光谱分析技术以其快速性、无损性、准确性等检测特点已经被广泛应用于各个领域，是现代快速检测的研究热点[8]。但直接使用光谱技术检测农药会存在光谱背景噪声干扰明显，检测精度难以满足定量要求等各种问题[9]，因此需将光谱技术和化学计量学分析方法结合起来。目前，直接采用光谱技术结合化学计量学分析方法快速定量检测水体中生物农药的研究未有报道。故本文选择阿维菌素为研究对象，使用光谱仪获取其不同浓度样本的紫外/可见光吸收光谱数据，对光谱数据进行预处理，样本集划分，剔除异常样本，筛选特征波长变量，建立偏最小二乘PLS 定量分析模型，实现对阿维菌素农药快速有效的定量检测研究。

1 材料与方法

1.1 样本配制

阿维菌素实验样本的配制：用1/10 000 电子天平称取90%阿维菌素0.066 7（±0.000 2）g，用少量甲醇超声溶解，然后用甲醇准确定容至600 mL，摇匀，得到浓度为100 mg·L-1的阿维菌素标准液。本次实验以纯净水为稀释剂，配制浓度为0.05 mg·L-1、0.1～2.0 mg·L-1（浓度梯度为0.1 mg·L-1）和6.0 mg·L-1共22 个不同浓度阿维菌素实验样本，再配制浓度为0.05 mg·L-1和0.1～6.0 mg·L-1（浓度梯度为0.1 mg·L-1）共61个不同浓度阿维菌素实验样本，每个样本溶液配制50 mL。

1.2 紫外/可见光谱数据采集

实验所用的光谱采集器为水体中有机磷无机磷含量检测仪，由美国Ocean Optics 海洋光学公司的Maya2000Pro光谱仪，型号为DT-MINI-2-GS的氘-卤钨灯组合光源以及可调光程比色皿支架构成。在PC机上安装与光谱仪配套的BiaoQi SpecSuite 软件，并设置积分时间为9 ms，平滑度为2，样本光谱平均次数为20，取其平均光谱数据为最终光谱数据。

1.3 比色皿光程优选

由朗伯-比尔定律A=Klc（A为吸光度，K为吸收系数，l为光程，c为吸光物质的浓度）[10]可知当吸光物质的浓度一定时，光程与吸光度呈线性关系，选择的比色皿光程越大，吸光度值越大。可供选择的光程比色皿有10、30、50、100 mm 4 种，为了提高低浓度阿维菌素农药样本的吸光度值，获得较强的光谱信号，又为防止高浓度阿维菌素农药样本的吸光度值过高，出现光谱信号失真的情况，选择一种最佳光程比色皿，得到最佳实验数据用于后续定量处理分析尤为重要，故本实验选择了50 mm 和100 mm 光程比色皿获取光谱数据进行对比。使用50 mm 光程比色皿采集了浓度范围为0.05 mg·L-1、0.1～2.0 mg·L-1（浓度梯度为0.1 mg·L-1）和6.0 mg·L-1共22个样本的光谱数据以及使用100 mm 光程比色皿采集了浓度范围为0.05 mg·L-1和0.1～6.0 mg·L-1（浓度梯度为0.1 mg·L-1）共61 个样本的光谱数据。

1.4 数据处理方法

本文采用Savitzky-Golay 卷积平滑法对光谱数据进行预处理，采用SPXY 算法划分样本集，采用主成分分析结合马氏距离算法（PCA-MD）剔除异常样本，采用竞争性自适应重加权采样算法（CARS）筛选特征波长变量。

1.4.1 光谱数据预处理

Savitzky-Golay 卷积平滑法（S-G 平滑法）又称多项式平滑法，通过多项式对移动窗口内的数据进行多项式最小二乘拟合，其实质是一种加权平均法[10]。当平滑窗口宽度选取恰当时，检测时仪器所引入的光谱数据噪声可有效降低。

1.4.2 样本集划分

SPXY（Sample set partitioning based on joint x-y distance）算法是由Galvao 等[11]基于K-S（Kennardstone）算法提出的，能对低浓度样本进行合理的划分。

1.4.3 剔除异常样本

主成分分析（Principle component analysis，PCA）是一种线性特征提取方法，可将光谱数据降维。采用主成分分析法对光谱数据进行处理，可得到光谱数据的主成分个数和得分数据。主成分个数选取是否恰当，会影响其预测模型精度的高低。马氏距离（Mahalanobis Distance，MD）表示数据的协方差距离，它是一种有效计算两个样本的相似度的方法。通过设置合适的距离阈值，可以剔除小于该阈值的样本数据[12]。PCA-MD 剔除异常样本即采用主成分分析方法获得光谱数据的主成分得分，计算各样本光谱数据得分到样本光谱数据平均得分的马氏距离，通过设置合理阈值剔除异常样本，进而得到有效样本。

1.4.4 筛选特征波长变量

竞争性自适应重加权采样法（Competitive adaptive reweighted sampling，CARS）是基于达尔文“适者生存”的思想，提出的基于迭代统计信息的变量选择算法[13]。利用蒙特卡罗采样、指数衰减函数和自适应重加权采样得到最佳的建模波长变量组合。

1.5 模型评价

PLS 是常用的一种基于线性回归的新型多元统计数据分析方法[14]。PLS 模型的评价系数包括决定系数（R2）、均方根误差（RMSE）剩余预测残差（RPD）和潜变量（LVs）。R2越接近1，RMSE（校正集RMSEC、预测集RMSEP）越小，模型精度越高。RPD 是预测集的标准偏差与预测均方根误差的比值，反映了模型的分辨能力和稳健性。RPD≥3 表示模型预测效果很好，可应用于定量分析和实际检测；2.5＜RPD＜3 表示此模型可以进行定量分析；RPD≤2.5表示此模型不适合进行定量分析[15]。LVs 的选择是否合理会直接影响到模型预测性能的好坏。

本文数据处理均基于MATLAB R2020b、Origin-Pro8.5和The Unscrambler X10.4软件平台进行。

2 结果与分析

2.1 光程优选、特征波段和特征吸收峰

50 mm 和100 mm 光程比色皿采集得到的不同浓度阿维菌素溶液的原始吸收光谱如图2、图3所示，波长范围200～900 nm。由图2、图3可见，两种光程比色皿采集的光谱数据均有一个明显的特征吸收峰，其波段均在243.5～247.3 nm 之间，近似在245.4 nm 处为其特征吸收峰。

图2 50 mm光程比色皿-阿维菌素原始吸收光谱图Figure 2 50 mm optical path cuvettes-original absorption spectra of avermectin

图3 100 mm光程比色皿-阿维菌素原始吸收光谱图Figure 3 100 mm optical path cuvettes-original absorption spectra of avermectin

又由图2、图3 可知，阿维菌素溶液浓度为6 mg·L-1时50 mm 和100 mm 光程比色皿光谱曲线达到最高吸光度值，分别为1.01 和2.09。可见100 mm 光程比色皿光谱曲线最高吸光度值比50 mm 光程比色皿光谱曲线最高吸光度值高一倍左右，其吸收光谱信号较强且未出现光谱信号失真的情况，有利于低浓度检测，故本文后续数据处理使用的光谱数据为通过100 mm 光程比色皿采集得到的61 个样本光谱数据。此外，由于阿维菌素农药在波长为500 nm 之后吸光度无限接近零，基本没有吸收，包含的光谱数据信息有限，研究价值较小，故本文后续数据处理波长范围选择200～500 nm，共计650个波长点。

2.2 S-G平滑预处理

采用平滑窗口宽度为3 的S-G 平滑法对200～500 nm 波长范围的阿维菌素原始光谱数据进行平滑去噪预处理，预处理后的光谱图如图4所示。由图3、图4 可知，经过S-G 平滑法预处理后的光谱曲线变平滑，说明S-G 平滑法提高了光谱的平滑性，降低了噪声的干扰，优化了光谱信号。

图4 S-G平滑法-阿维菌素吸收光谱图Figure 4 S-G smoothing method-absorption spectra of avermectin

2.3 PLS模型预测结果

2.3.1 SPXY算法划分样本集后建立PLS预测模型

将原始光谱数据和S-G 平滑法预处理后的光谱数据采用SPXY 算法校正集和预测集分别按2∶1比例和3∶1 比例（SPXY 算法样本集划分最常用的两种比例）进行样本集划分，分别建立PLS定量分析模型，结果见表1。

表1 PLS模型预测结果Table 1 PLS model prediction results

由表1可知，无论是原始数据还是原始数据经SG 平滑法预处理后采用SPXY 算法进行样本集划分后，所建立的PLS 模型均有较高的精度，满足定量分析的要求，说明利用光谱技术结合化学计量学分析方法可以快速检测水体中生物农药阿维菌素的浓度。

原始数据以及原始数据经S-G平滑法预处理后，采用SPXY 算法校正集和预测集按3∶1比例划分后建立的模型均比按2∶1 比例建立的模型精度更高，稳健性更好，尤其是RPD 值，分别从20.031 2、19.983 3 提升为28.425 5、28.499 7。

数据S-G平滑预处理对所建立的模型精度影响较小，S-G-SPXY（2∶1）-PLS 模型比Original data-SPXY（2∶1）-PLS 模型效果略差的原因可能是由误差导致的；而效果最好的是S-G-SPXY（3∶1）-PLS 模型，其R2p为0.998 7，RMSEP为0.070 4，RPD为28.499 7。

2.3.2 PCA-MD 剔除异常样本和CARS 筛选特征波长后建立PLS预测模型

为了进一步优化模型，采用PCA-MD算法、CARS算法和PCA-MD 算法结合CARS 算法分别对2.3.1 优选出的原始数据经S-G平滑法预处理后采用SPXY算法校正集和预测集按3∶1比例划分后的光谱数据进行剔除异常样本处理、筛选特征波长变量处理以及剔除异常样本后再筛选特征波长变量处理，分别建立PLS模型，结果见表2。

表2 PLS模型预测结果Table 2 PLS model prediction results

由表1、表2可知，采用PCA-MD 算法剔除异常样本后建立的S-G-SPXY（3∶1）-（PCA-MD）-PLS 模型比S-G-SPXY（3∶1）-PLS 模型的RMSEP 值小，从0.070 4 降至0.065 1，但R2p 和RPD 值也略有减小，故模型预测效果变化不大。

采用CARS 算法筛选特征波长变量后建立的SG-SPXY（3∶1）-CARS-PLS 模型与S-G-SPXY（3∶1）-PLS 模型相比波长变量数明显减小，从650 个减少至20 个，减少了96.92%，简化了模型，但其模型预测效果变化也不大。

采用PCA-MD算法剔除异常样本后再采用CARS算法筛选特征波长变量后建立的S-G-SPXY（3∶1）-（PCA-MD）-CARS-PLS 模型筛选出的特征波长变量数为28个，与S-G-SPXY（3∶1）-PLS 模型相比减少了95.69%，其R2p 值为0.998 8，RMSEP 值为0.061 1，RPD 值为29.589 4，模型精度更高，稳健性更好，简化模型的同时也有效提高了模型的预测效果。

阿维菌素紫外/可见吸收光谱S-G-SPXY（3∶1）-（PCA-MD）-CARS-PLS模型具体公式表达如下：

式中：Y表示阿维菌素农药浓度；Xn表示阿维菌素农药在特征波长点n处的吸光度值。

阿维菌素不同浓度下S-G-SPXY（3∶1）-（PCAMD）-CARS-PLS模型预测结果如图5所示。由图5可知，阿维菌素浓度样本校正集的真实浓度与预测浓度的线性拟合图与预测集的真实浓度与预测浓度的线性拟合图几乎重合，模型预测效果较好，可见利用紫外/可见吸收光谱测量技术结合化学计量学分析方法快速检测水体中生物农药阿维菌素浓度是可行的。

图5 S-G-SPXY（3∶1）-（PCA-MD）-CARS-PLS模型预测结果Figure 5 S-G-SPXY（3∶1）-（PCA-MD）-CARS-PLS model prediction result graph

3 讨论

对于实际复杂自然环境水体，例如农田水中生物农药阿维菌素含量的快速检测还有待继续深入研究。采用光谱仪获得复杂自然环境水体中阿维菌素不同浓度下的复杂光谱数据，建立浓度预测模型，实现对复杂自然环境水体中阿维菌素的快速定性定量分析。可采用化学计量学二阶校正分析方法如平行因子法（PARAFAC）[16]、交替三线性分解法（ATLD）[17]、自加权交替三线性分解法（SWATLD）、交替惩罚三线性分解法（APTLD）和多维偏最小二乘法（N-PLS）等对获得的复杂光谱数据进行分解分析，建立基于二阶校正方法的多元回归浓度预测模型。但是对二阶校正方法（上述各种算法）的理解掌握和运行是一个难点，以及使用二阶校正方法处理的数据必须是二阶张量数据，即所谓的三维数据矩阵（包含的样本信息更全面，能够提取的有用信息也相对变多）。而本文采用光谱仪获得的数据是二维吸光度光谱数据矩阵，因此，如何把获得的二维数据构建成适用于二阶校正方法的三维数据矩阵进行二阶校正分析也是一个难点。后续深入研究需注意攻克以上难点，实现对实际自然环境受污染水域的大面积快速筛查监测。

4 结论

（1）采用100 mm 光程比色皿采集阿维菌素溶液样本从低浓度0.05 mg·L-1到高浓度6.0 mg·L-1所得的光谱吸光度值更好，243.5～247.3 nm 为其特征吸收峰波段，245.4 nm处近似为其特征吸收峰。

（2）利用紫外/可见吸收光谱测量技术获得的不同浓度下的阿维菌素的原始光谱数据建立的PLS预测模型具有较高的精度，完全满足定量分析的要求，说明采用紫外/可见吸收光谱法结合化学计量学分析方法快速检测纯净水中生物农药阿维菌素浓度是可行的。原始数据经S-G 平滑、SPXY 算法以3∶1 比例划分校正集和预测集、PCA-MD 算法剔除异常样本，CARS 算法筛选特征波长后所建立的PLS 模型更优。