阿托伐他汀对牙周炎大鼠的影响及可能机制

武 扬，李 丽

（山西白求恩医院/同济山西医院/山西医科大学第三医院，太原 030002）

牙周炎是临床常见的口腔疾病，好发于35 岁以上人群，发病率随年龄的增长而升高，可导致牙龈红肿、出血、牙周囊袋形成、牙槽骨吸收及牙齿松动等口腔问题[1]。目前，牙周炎的治疗主要包括机械清创、药物治疗及外科手术等方式，通过清除牙周囊袋内牙菌斑及牙结石，使用抗生素等药物控制感染，或彻底清除深部感染灶，重建牙周组织生理结构和功能，但难以彻底清除全部细菌，且存在易复发、手术创伤大及恢复缓慢等问题，无法完全阻止或逆转牙槽骨吸收[3]。阿托伐他汀（atorvastatin，ATV）是一种广泛应用于高胆固醇血症及心血管病预防的药物，近年来发现其具有抗炎、抗氧化及促进骨形成等多种生物学效应[4-5]。ATV 能够改善牙周炎患者临床指标，减少牙周组织中炎性细胞因子水平及牙周袋深度[6]。但ATV 对牙周炎牙槽骨吸收情况的影响及可能机制尚不清楚。本研究通过建立牙周炎大鼠模型，观察ATV 对其牙槽骨吸收及炎症反应的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

62 只SD 大鼠，SPF 级，雄性，8 周龄，体质量（300±20）g，购自上海昇敞生物科技有限公司，生产许可SCXK（沪）2021-0002。大鼠在12 h/12 h光暗循环、温度（22±2）℃、湿度（55±5）%的条件下饲养，自由进食和饮水。实验前1 周进行适应性喂养。本研究获院伦理委员会批准（伦理批号：2023078-J356）。

1.2 药物、主要试剂与仪器

阿托伐他汀钙片，辉瑞制药有限公司，规格：每片20 mg，批准文号：国药准字H20051408；无翅型MMTV 整合位点家族蛋白（Wnt）/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路抑制剂XAV939，美国TargetMol公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-17（IL-17）、白介素-10（IL-10）酶联免疫吸附试剂盒，上海远慕生物科技有限公司；兔抗大鼠β-catenin、p-β-catenin、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、Runt相关转录因子2（Runx2）一抗，日本MBL 公司。

锥形束CT（CBCT）扫描仪，意大利NewTom VGi 公司；SZX10 显微镜，日本OLYMPUS 株式会社；Doc EZ 凝胶成像分析系统，美国伯乐公司。

1.3 构建牙周炎大鼠模型

腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，仰卧位固定于手术架，用无菌手术刀在大鼠左上颌第一磨牙和第二磨牙之间的牙龈上切开1 个约3 mm 长的口，将1根4-0 丝线穿过口中，沿着牙颈部缝合，使丝线紧贴牙面，形成1 个牙周袋。右上颌第一磨牙和第二磨牙之间的牙龈上进行同样的操作。结扎后每天更换1 次丝线，以维持牙周炎持续性。以建模结扎8周后，牙龈红肿、探诊出血及牙周袋形成为造模成功标准[7]。

1.4 干预方式及分组

从62 只大鼠中随机选取15 只不做处理，设为健康组，其余47 只构建牙周炎模型，成功45 只，随机分为牙周炎组、ATV 组、联合组，各15 只。建模成功后，ATV 组大鼠灌胃阿托伐他汀钙生理盐水溶液5 mL（含阿托伐他汀钙3 mg·kg-1）[8]，1 h 后腹腔注射二甲基亚砜（DMSO）溶液0.2 mL；联合组大鼠灌胃阿托伐他汀钙生理盐水溶液5 mL（剂量3 mg·kg-1），1 h 后腹腔注射XAV939 DMSO 溶液0.2 mL（剂量20 mg·kg-1）[9]；健康组、牙周炎组大鼠灌胃生理盐水溶液5 mL，1 h 后腹腔注射DMSO 溶液0.2 mL，每日1 次，持续干预4 周。

1.5 检测牙周炎相关指标

末次干预后检测。牙龈出血指数（SBI）：将每颗牙分为近中颊侧、近中舌侧、远中颊侧、远中舌侧、中间颊侧、中间舌侧6 个区域，用探针沿着龈沟插入约1 mm 深度，轻轻刮动后拔出，观察有无出血，并按照以下标准进行评分：0 分，无出血；1 分，探针拔出后有点状出血；2 分，探针拔出后有线状出血；3 分，探针拔出后有大片出血或自发性出血。菌斑指数（PLI）：棉签蘸取2%碱性品红滴至建模牙齿处，30 s 后蒸馏水冲洗，将每颗牙分为近中、远中、颊侧、舌侧或腭侧4 个区域，用探针轻触牙面，以紫红色面积及深浅程度判断是否出现菌斑，并按照以下标准进行评分：0 分，无菌斑；1 分，牙颈部有细小菌斑，仅用探针或镜片才能发现；2 分，牙颈部有中等量的菌斑，肉眼可见；3 分，牙颈部有大量的菌斑，覆盖整个牙面。

1.6 检测血清TNF-α、IL-17、IL-10水平

末次干预后，各组大鼠均禁食12 h，麻醉后抽取腹主动脉血，采用酶联免疫吸附试验法检测血清TNF-α、IL-17、IL-10 水平。将动脉血样品按照说明书稀释比例加入预先包被有TNF-α、IL-17、IL-10特异性抗体微孔板中，在37℃下孵育2 h，去除液体并洗涤5 次，加入生物素标记的TNF-α、IL-17、IL-10 特异性二抗，在37℃下孵育1 h，去除液体并洗涤5 次，加入链霉亲和素-过氧化物酶复合物，在37℃下孵育30 min，去除液体并洗涤5 次，加入底物溶液，在室温下孵育15 min，加入终止液，用酶标仪（450 nm 波长）测定吸光度，并根据标准曲线计算样本浓度。

1.7 CBCT 观察牙槽骨吸收情况

取血后，每组大鼠随机选择5 只颈椎脱臼处死，10%中性缓冲甲醛溶液固定大鼠下颌，修正标本后将下颌置于CBCT 扫描仪中，采用以下参数进行扫描：管电压110 kV，管电流3 mA，层厚0.3 mm，像素尺寸0.125 mm。利用NNT 软件对扫描图像进行重建和分析，测量骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数目（Tb.N）、骨小梁分离度（Tb.Sp），以及下颌第一磨牙远中根的牙槽骨高度，即从釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离（CEJ-AC）。由2 名经过培训的观察者独立进行测量，重复3 次，取平均值。

1.8 HE 染色观察牙周组织形态学变化

每组剩余大鼠随机选择5 只颈椎脱臼处死，并取建模牙及其周围牙周组织，分成2 份，1 份固定在10%中性缓冲甲醛溶液中24 h，采用10% EDTA脱钙液脱钙，常规脱水、透明、包埋、切片，厚度为5 μm，采用HE 染色法对切片进行染色，用光学显微镜观察并拍照；1 份投入液氮中保存。利用Image-Pro Plus 软件分析图片，测量下颌第一磨牙远中根的上皮附着丧失量，即从牙槽嵴顶到上皮附着点的距离。由2 名经过培训的观察者独立进行测量，重复3 次，取平均值。

1.9 免疫印迹法检测检测牙周组织β-catenin 、p-βcatenin 、GSK-3β、Runx2蛋白表达量

取液氮冻存牙周组织，超声波破碎后，匀浆、裂解，注入离心管内提取总蛋白，采用Bradford 法测定蛋白质浓度。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离后，转印到聚氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶在室温下孵育1 h 以封闭非特异性结合位点，TBST 清洗，用β-catenin、p-β-catenin、GSK-3β、Runx2 的特异性兔多克隆抗体（1:500 稀释）在4℃下过夜孵育，TBST 清洗，碘化半胱氨酸标记的羊抗兔二抗（1:2 000 稀释）在室温下孵育1 h，用增强型化学发光法检测信号，并用GAPDH 作为内参。用图像分析软件Image-Pro Plus 测量各条带灰度值，并计算其相对表达量（目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值）。

1.10 统计学方法

采用IBM SPSS 24.0 分析数据，以均数±标准差（±s）描述计量资料，以单因素方差分析比较多样本计量资料，以LSD-t检验比较两两样本。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠SBI、PLI比较

见表1。

表1 各组大鼠SBI、PLI 比较（±s ，n= 15） 分

表1 各组大鼠SBI、PLI 比较（±s ，n= 15） 分

注：与健康组比较，# P ＜0.05；与牙周炎组比较，△P ＜0.05；与ATV 组比较，▲P ＜0.05

组别SBIPLI健康组0.18±0.020.17±0.04牙周炎组1.40±0.19#1.56±0.23#ATV 组0.55±0.07△0.68±0.07△联合组0.79±0.12▲1.02±0.38▲

2.2 各组大鼠血清炎症因子水平比较

见表2。

表2 各组大鼠血清炎症因子水平比较（±s ，n= 15）

表2 各组大鼠血清炎症因子水平比较（±s ，n= 15）

注：与健康组比较，# P ＜0.05；与牙周炎组比较，△P ＜0.05；与ATV 组比较，▲P ＜0.05

组别TNF-α/（ng·mL-1）IL-17/（pg·mL-1）IL-10/（pg·mL-1）健康组 71.15±10.33 4.33±0.579.98±2.35牙周炎组285.47±52.14#15.35±2.49#2.42±0.37#ATV 组129.93±24.52△ 9.12±1.26△5.20±0.78△联合组177.09±22.15▲13.86±3.35▲3.06±0.92▲

2.3 各组大鼠牙槽骨吸收指标比较

见表3。

表3 各组大鼠牙槽骨吸收指标比较（±s ，n= 5）

表3 各组大鼠牙槽骨吸收指标比较（±s ，n= 5）

注：与健康组比较，# P ＜0.05；与牙周炎组比较，△P ＜0.05；与ATV 组比较，▲P ＜0.05

组别Tb.Th/mmTb.N/（个/mm）Tb.Sp/mmCEJ-AC/mm健康组0.19±0.045.23±0.780.12±0.031.07±0.19牙周炎组0.07±0.02#4.02±0.53#0.25±0.08#2.51±0.47#ATV 组0.14±0.15△4.96±0.46△0.16±0.04△1.93±0.18△联合组0.10±0.03▲4.05±0.08▲0.20±0.05▲2.25±0.26▲

2.4 牙周组织病理改变

HE 染色显示，对照组牙周膜及牙龈上皮结构形态完整，牙周组织细胞形态正常，胶原纤维排列紧密，未出现牙槽骨吸收现象及炎症细胞；模型组牙龈上皮结构严重破坏，上皮组织糜烂，胶原纤维变性断裂，牙槽骨内出现明显吸收凹陷，可见大量炎症细胞弥散状分布，深牙周袋形成，牙槽嵴顶到釉牙骨质界间距增大；与模型组比较，ATV 组、联合组牙槽骨形态得以改善，炎症细胞数量减少，偶见部分新生胶原纤维。与联合组比较，ATV 组牙周损伤改善更为显著。见图1。

图1 牙周组织病理改变（HE 染色，×400）

2.5 各组牙周组织GSK-3β、Runx2蛋白表达量，p-β-catenin/β-catenin 比较

见表4，图2。

表4 各组牙周组织GSK-3β、Runx2蛋白表达量，p-β-catenin/β-catenin 比较（±s，n = 5）

表4 各组牙周组织GSK-3β、Runx2蛋白表达量，p-β-catenin/β-catenin 比较（±s，n = 5）

注：与健康组比较，# P ＜0.05；与牙周炎组比较，△P ＜0.05；与ATV 组比较，▲P ＜0.05

组别p-β-catenin/β-cateninGSK-3βRunx2健康组0.81±0.230.09±0.020.83±0.11牙周炎组0.12±0.04#0.96±0.17# 0.20±0.05#ATV 组0.58±0.06△0.19±0.04△ 0.52±0.07△联合组0.32±0.04▲0.41±0.06▲ 0.35±0.05▲

图2 牙周组织β-catenin 、p-β-catenin 、GSK-3β、Runx2蛋白表达量

3 讨论

吸烟、糖尿病、口腔卫生习惯不佳、生活压力、遗传、牙齿不齐及女性激素变化等是牙周炎发病的主要危险因素。牙周炎发生和发展涉及口腔微生物、宿主过量免疫、炎症反应及骨吸收- 形成平衡失调等多个机制，牙槽骨吸收、过量炎症反应被认为是该病进展的主要原因[10-12]。牙周炎患者口腔内存在大量致病菌，可刺激宿主产生TNF-α、白介素-17 等促炎因子，并抑制抑炎因子IL-10 分泌，可直接或间接增加细胞核因子κB 受体活化因子配体（RANKL）表达，降低骨保护蛋白（OPG）水平，导致成骨细胞过度形成和活化。

本研究结果显示，ATV 组SBI、PLI、TNF-α、IL-17、IL-10、Tb.Sp、CEJ-AC 均低于牙周炎组，IL-10、Tb.Th、Tb.N 均高于牙周炎组，提示ATV 可改善牙周炎大鼠牙周指标，抑制牙槽骨吸收及炎症反应。ATV 是一种抑制HMG-CoA 还原酶的药物，具有调节骨代谢、抑制炎症和氧化应激、促进上皮化及创伤愈合等作用，可通过多种途径减轻口腔生物膜相关慢性炎症性疾病：抑制细胞因子、前列腺素、基质金属蛋白酶等促炎因子释放，促进IL-10、白介素-4、白介素-13 等抗炎因子产生，控制牙周组织炎症反应；调节宿主对细菌刺激反应，防止炎症介导的牙槽骨吸收，促进牙槽骨形成；抑制细菌生长、破坏细菌膜稳定性并增加细菌清除率，从而避免感染恶化[13]。

Wnt/β-catenin 信号通路是一种在多种生物过程中发挥重要作用的信号转导通路，是细胞生长、分化的重要调控途径。当Wnt 信号激活时，Wnt 蛋白与Frizzled 受体和LRP5/6 结合，从而抑制GSK-3β 对游离β-catenin 促磷酸化作用，促进其转运到细胞核内，与T-cell 因子/淋巴样增强因子家族转录因子结合，激活下游靶向因子Runx2 表达，从而调节骨吸收细胞和骨形成细胞间的平衡[14]。Wnt/β-catenin 信号通路还参与炎症反应调节，影响细胞因子、趋化因子及黏附分子等表达，调节炎症细胞的迁移和活化。本研究结果显示，牙周炎组牙周组织Runx2 蛋白表达量、p-β-catenin/β-catenin 低于健康组，GSK-3β 蛋白表达量高于健康组，经ATV 干预后Runx2 蛋白表达量、p-β-catenin/β-catenin 升高，GSK-3β 蛋白表达量降低，提示该通路在牙周炎中被抑制，经ATV 干预后有所改善。此外，在ATV 干预的基础上增用Wnt/β-catenin 信号通路抑制剂可降低ATV 治疗效果，提示ATV 可能通过激活该通路发挥对牙周炎的治疗作用。

综上所述，ATV 可改善牙周炎大鼠牙周指标，抑制牙槽骨吸收，减轻炎症反应，其作用机制可能与调控Wnt/β-catenin 信号通路有关。