奶粉中饱和烃与芳香烃矿物油的高灵敏检测方法建立

刘玲玲，李冰宁，杨梦奇，李 婷，武彦文

（北京市科学技术研究院分析测试研究所（北京市理化分析测试中心），北京 100094）

近年来，公众对矿物油污染逐渐重视，特别是2019 年非政府组织Foodwatch 发布报告，指出婴幼儿配方奶粉含有芳烃矿物油（mineral oil aromatic hydrocarbons，MOAH）[1]之后，人们对矿物油的关注度提高，相关部门的监管规定和方法要求也逐年升级。2019 年，欧洲食品安全局（EFSA）开展了针对奶粉中矿物油的风险评估[2]；2020 年，欧洲联合研究中心（JRC）开始着手建立奶粉中MOAH 的检测规范[3]；2022 年，德国食品联合会（BLL）推出包含奶粉在内的9 大类食品中矿物油的基准值[4]；同年，欧盟植物、动物、食品和饲料常务委员会（SCoPAFF）发布了“关于食品（包括婴幼儿食品）中MOAH 的联合声明草案”，规定奶粉中矿物油的限量为1 mg/kg[5]。

矿物油源于石油和合成油，石化企业生产的柴油、润滑油、溶剂油、白油等均为矿物油产品[6]。因此，矿物油可以通过食品生产链的各个环节（如原料种/养植、运输、加工、包装与环境污染等）迁移至食品造成污染[7-12]。2012 年，EFSA 给出食品中矿物油污染物的定义，即沸程范围n-C10～n-C50的所有碳氢化合物，可粗略分为饱和烃矿物油（mineral oil saturated hydrocarbons，MOSH）和MOAH 两类[6]。MOSH和MOAH 的毒性差异很大，MOSH 容易蓄积在肝脏、脾脏、淋巴结等器官和组织中形成微型肉芽肿；MOAH 则有潜在的致癌、致畸和发育毒性[13-15]。

目前国内外并没有出台奶粉中矿物油的检测标准。矿物油是由数以万计烃类化合物组成的混合物，其化学类型复杂，一般测其总量。气相色谱（gas chromatography，GC）的氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）具有等碳响应，无需一一对应标准对照物，只用任意内标即可准确定量，是目前测定矿物油的理想方法[16-17]。然而，由于样品基质复杂，矿物油含量低，常规GC-FID 的选择性和灵敏度无法满足分析要求。而高效液相色谱-气相色谱联用（on-line high-performance liquid chromatography coupled with gas chromatography，HPLC-GC）仪器通过HPLC 分离解决了矿物油的净化问题，通过HPLC与GC 之间的接口技术从数量级上提升了方法的灵敏度，从而较好地实现了矿物油的准确测定。缺点是其高度定制化限定了HPLC 硅胶柱的规格，HPLC硅胶柱只能吸附20 mg 油脂[16]，这意味着该仪器的净化容量有限，因此，干扰物质的有效去除是奶粉中矿物油测定技术的难点。

本文根据奶粉的基质特点，参考欧盟要求[5]，综合现有的油脂标准[18]和文献[19-22]方法，系统研究了称样量、皂化反应条件、正己烷提取方法、硅胶柱和环氧化净化方法，最后通过HPLC-GC 分析，以期建立奶粉中MOSH 和MOAH 的高灵敏度检测方法，从而作为食品企业、监管和检测机构的常规检测方法，也可用于未来制定奶粉等相关标准的参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

婴幼儿配方奶粉 市售；奶粉样品（RVEP 200612）由德国标物局（DRRR）于2020 年组织国际能力验证；正己烷（色谱纯）、二氯甲烷（色谱纯）、无水乙醇（色谱纯）、硅胶（63～200 μm，以400 ℃烘烤16 h、置于干燥器中冷却至室温）德国默克公司；氢氧化钾 分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫代硫酸钠和无水硫酸钠 分析纯，国药集团化学试剂公司；3-氯过氧苯甲酸（m-CPBA）分析纯，赛默飞世尔科技公司；MOSH/MOAH 混合标准溶液 含9 种单体化合物，分别为300 mg/L 的正十一烷（n-undecane，n-C11）、环己基环己烷（bicyclohexyl，Cycy）、戊基苯（amylbenzene，5B）、1-甲基萘（1-methylnaphthalene，1-MN）、2-甲基萘（2-methylnaphthalene，2-MN）、1,3,5-三叔丁基苯（1,3,5-tritert-butylbenzene，TBB）、150 mg/L 的正十三烷（n-tridecane，n-C13）和600 mg/L 的胆甾烷（5-alphacholestane，Cho）、苝（perylene，Per）北京坛墨质检科技有限公司；正构烷烃混合标准溶液 配制含100 mg/L 的n-C10、n-C11、n-C13、n-C16、n-C20、n-C24、n-C25、n-C35、n-C40和n-C50的标准溶液，其中标准品均购自美国Restek 公司。

HPLC-GC 联用仪器 由日本岛津公司的LC 20AD 液相色谱仪（配备紫外检测器）和2010 plus 气相色谱仪[配备氢火焰离子化检测器（FID）]以及德国Axel Semrau 公司的LC-GC 接口组成；SHZ-B 水浴恒温振荡器 上海博迅医疗生物仪器公司；Biofuge primo R 低温高速 赛默飞世尔科技公司；R-100 旋转蒸发仪、B-290 喷雾干燥仪 瑞士步琦公司；TUS-200P 金属浴恒温振荡器 上海一恒科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 皂化反应 准确称量奶粉试样5.0 g（精确至1 mg）于100 mL 玻璃离心瓶中，加入MOSH/MOAH混合标准溶液10 μL，加入温热（35～50 ℃）去离子水10 mL，振荡至没有明显结块；然后加入浓度为0.6 g/mL氢氧化钾水溶液10 mL 和无水乙醇20 mL，摇匀后于60 ℃皂化反应30 min；冷却至室温后向皂化液加入正己烷15 mL，振荡5 min 后加入去离子水10 mL，剧烈振荡、离心后取上清液；再次加入正己烷10 mL 重复提取，振荡分层后取上清液，合并，减压浓缩至约2～3 mL。

1.2.2 脂肪相对残留率测定 为了测定皂化后提取液中的脂肪相对残留率，将上述萃取物（1.2.1）蒸发至干燥，直到恒定重量，见公式（1）。

式中：X 为脂肪相对残留率，%；m1为恒重后脂肪收集瓶和脂肪质量，g；m2为恒重后脂肪收集瓶的质量，g；m3为空白实验中，恒重后脂肪收集瓶和脂肪质量，g；m4为空白实验中，恒重后脂肪收集瓶的质量，g；m 为样品质量，g；x 为样品标签上脂肪含量，%。

1.2.3 硅胶净化 将3 g 活化硅胶装入内径为11～13 mm 的底部有烧结筛板或垫入滤纸或玻璃棉的玻璃层析柱，在上层覆盖约1 g 无水硫酸钠；取浓缩液（1.2.1），加入乙醇-水（1:1，v/v）5 mL，振荡、静置分层、取上清液；全部转移至硅胶柱，用15 mL 二氯甲烷-正己烷（3:7，v/v）混合溶剂洗脱，收集流出液，减压浓缩至约1 mL。

1.2.4 环氧化反应 向浓缩液（1.2.2）中加入0.5 mL的m-CPBA 乙醇溶液（200 mg/mL，2 g m-CPBA 用乙醇定容至10 mL），以40 ℃振荡反应20 min；然后加入乙醇0.5 mL 和浓度为100 mg/mL 硫代硫酸钠溶液2 mL 以终止反应，取正己烷层用于HPLCGC 分析。

1.2.5 HPLC-GC 分析 HPLC 色谱柱为Restek Allure Si（250 mm×2.1 mm，内径5 μm），流动相为（A）正己烷，（B）二氯甲烷；采用梯度洗脱程序：0～0.1 min，100% A（流速为0.3 mL/min）；0.1～6.2 min，70% A（流速为0.3 mL/min）；6.2～15.2 min，100% B（反冲，流速为0.5 mL/min）；15.2～25.2 min，100% A（流速为0.5 mL/min）；25.2～30 min，100% A（流速为0.3 mL/min）。进样体积为100 μL；以紫外检测器（230 nm）监测HPLC 的流出情况，此条件下的MOSH 部分于2.0～3.5 min、MOAH 于4.5～6.0 min流出；两部分分别通过阀切换全部导入GC 分析。

GC 仪器配置两套完全相同的通道，每个通道均采用Restek MXT 无涂层毛细管预柱（10 m×0.53 mm）和Restek MXT-1 分析柱（15 m×0.25 mm，内径0.25 μm），预柱与分析柱之间以三通管连接溶剂排空阀[17]。柱温箱的升温程序：初始温度为60 ℃，保持6 min，以15 ℃/min 的速度升温至120 ℃，然后再以25 ℃/min 的速度升温至370 ℃，保持6 min；载气为氢气（纯度≥99.995%），MOSH 和MOAH 通道的初始压力分别为80 和79 kPa；FID 温度为380 ℃；FID 的辅助气为氮气（流速30mL/min）、燃烧气为氢气（流速40 mL/min）、助燃气为空气（流速400 mL/min）。

1.2.6 加标样品制备 对于奶粉样品，特别是婴幼儿配方奶粉，其矿物油来源除了包装材料迁移至奶粉颗粒表面之外，还有可能来源于奶粉的配料，而奶粉配料中的矿物油往往被奶粉的蛋白质颗粒包裹，简单的加标回收率并不能反映矿物油分析方法的准确性。本文将奶粉用35～50 ℃的温水溶解，加入不同浓度的矿物油溶液，均质后采用喷雾干燥法制备加标样品。喷雾干燥器进风温度为130 ℃，出风温度为80 ℃[23]。

1.3 数据处理

定量方法为内标法，分别以MOSH/MOAH 混合标准溶液中的Cycy 和TBB 为内标物对MOSH和MOAH 定量。MOSH 和MOAH 的谱图均为跨越一定碳数范围的鼓包峰，其含量通过积分计算鼓包峰与基线之间的空白面积与内标峰的面积比获得；鼓包峰上方的尖峰不是矿物油，需要减去[18]。本文采用 Lab solution 软件进行数据处理，最终结果运用Excel 表格进行计算。本文所用色谱图均直接应用Lab solution 软件复制原图。

2 结果与分析

2.1 样品制备

2.1.1 称样量 本文参考欧盟的分析要求与限量规定建立方法。2019 年，JRC 给出食品中矿物油的分析方法指导，对于脂肪含量>4%的LOQ 不能超过1 mg/kg[19]。2022 年，欧盟SCoPAFF 要求脂肪含量大于4%食品的矿物油限量为1 mg/kg[5]。因此，奶粉中的MOSH 和MOAH 的分析方法LOQ 不能超过1 mg/kg。

矿物油分析方法的LOQ 与样品称样量密切相关。根据文献经验，至少50～100 ng 矿物油注入FID才能满足分析不确定度要求[16]。由此计算，称量5.0 g 奶粉样品，经过提取、净化、浓缩至1 mL 试液，其中100 μL 注入HPLC-GC 分析，即相当于0.5 g样品中的目标物进入仪器，则该分析方法LOQ 为0.2 mg/kg。考察到矿物油的鼓包峰是通过积分计算鼓包峰与基线之间的空白面积得到，样品前处理，如提取、净化、浓缩等操作步骤均会引起基线波动，因此将方法的LOQ 定为0.5 mg/kg 相对稳妥。

2.1.2 皂化反应 通常，奶粉中含有20%～30%的油脂。油脂是矿物油的共提取物，如果不去除，会影响分析灵敏度，是由于HPLC 柱的规格限制油脂不能超过20 mg。以油脂为例，其直接进样的LOQ 只能达到10 mg/kg[18]。为了降低定量限，必须事先除去油脂，从而允许高浓度矿物油试液进入仪器测定。

皂化反应能够增大矿物油与甘油三酯的极性差异，从而达到分离、去除油脂的目的。皂化反应需要考虑甘油三酯（底物）与氢氧化钾溶液的浓度、溶剂体系、反应温度和反应时间等条件。“2.1.1”部分已经确定奶粉的称样量为5.0 g，为了反应彻底，首先需要将奶粉均匀分散。借鉴本实验室先前方法[17]，加入约10 mL 热水（35～50 ℃），充分搅拌后再加入氢氧化钾水溶液皂化。矿物油涉及低沸点物质，为了避免挥发损失，JRC 建议皂化条件为60 ℃下反应30 min[3]。因此，本文仅需要考察皂化反应的强碱浓度及其所处的溶剂体系。

随机选取一种购买的婴幼儿配方奶粉（产品标签标明脂肪含量为26.5%），通过测定皂化反应后脂肪的相对残留率，综合考察了氢氧化钾溶液浓度与乙醇添加量对皂化反应的影响（表1）。结果表明：当反应体系中氢氧化钾量达到 6 g（即溶液中氢氧化钾达到3 mol/L）以上时，甘油三酯完全分解[21]。甘油三酯与强碱的摩尔比为1:3 时皂化反应完全，根据5.0 g 奶粉可以粗略估算出油脂含量，即甘油三酯的质量为1～1.5 g，继而可以确定氢氧化钾的浓度。为了反应完全，实际操作中碱的添加量通常都是过量的。

表1 氢氧化钾和乙醇的不同添加量对皂化反应的影响Table 1 Effect of the different addition amount of potassium hydroxide and ethanol on saponification results

乙醇添加量对皂化反应效率影响很大，实验结果（表1）表明，当加入15 mL 乙醇，即反应体系中乙醇和水的体积相当（≈15 mL）时，皂化反应不完全；当乙醇的体积为20 mL 时，皂化效率明显提高，但残留脂肪率为0.6%～13.1%，重复性较差，皂化反应稳定性较差。此时，增加氢氧化钾的量，即从3 g 增加到6 g 时，残留脂肪率为0.6%～0.8%，皂化反应重复性和稳定性好。甘油三酯与浓碱水溶液不能互溶，需要加入一定量的乙醇作为溶剂并不断振荡，以加快皂化反应。因此，确定皂化条件为5.0 g 奶粉以10 mL 温水溶解，然后加入浓度为0.6 g/mL 的氢氧化钾水溶液10 mL 和乙醇20 mL，摇匀后于60 ℃下皂化反应30 min。皂化反应是否完全，可以通过观察正己烷相上方的脂肪层，如果存在脂肪层，则继续反应至其消失。

2.1.3 提取次数 一次提取往往不能保证回收率，本文将奶粉样品加入MOSH/MOAH 混合标准溶液经皂化反应（1.2.1），考察正己烷提取次数对MOSH/MOAH 混合标准溶液回收率的影响，其中第1 次用15 mL 正己烷提取，第2 次则另外添加10 mL 正己烷。由表2 可知，合并两次提取液测得的MOSH 和MOAH 的含量反而降低；对比两次提取液中MOSH/MOAH 混合标准溶液中的单体内标物质的比例（3 种MOSH 内标物质与n-C13的浓度比值，4 种MOAH 内标物质与TBB 的浓度比值），发现MOSH部分一次即可提取完全，而MOAH 部分则需要经过两次提取，其回收率才能达到0.97 以上，考虑到定量内标（Cycy 和MN）的回收率对分析结果的影响很大，本文的正己烷提取步骤确定为两次。

表2 正己烷提取次数的考察Table 2 Influence of extraction times of hexane on the determination of mineral oil hydrocarbons

同时，表2 的提取次数考察结果也说明，具有两个苯环的1-MN 和2-MN 在皂化反应和正己烷提取步骤中存在一定损失。为了尽可能降低定量结果的差异，采用TBB 作为定量内标。

2.1.4 硅胶净化 实际操作中发现奶粉的皂化-提取液经过浓缩后，其中极性物质（如碱液、溶剂杂质等）也相应得到富集，影响后续的环氧化反应，因此需要对浓缩液进行净化。根据浓缩液的体积（一般为2～3 mL），乙醇-水（1:1，v/v）的添加量为5 mL。此外，很多实验室建议再增加一步硅胶净化步骤，如德国脂肪学会（DGF）最新修订的油脂标准[22]。因此，本方法也将洗涤后的试液以硅胶净化。由于油脂已经通过皂化去除，因而净化柱中的硅胶量参照欧盟标准[15]成比例降低，3 g 硅胶即可以达到净化目的。

2.1.5 环氧化反应 为了保证营养均衡，奶粉，特别是婴幼儿配方奶粉中常常添加葵花籽油、玉米油、棕榈油等植物油脂[24]。然而，这些物油脂中的角鲨烯、胡萝卜素和甾烯等会干扰MOAH，其原因是这些烯烃的极性与MOAH 相近，与MOAH 产生共流出，干扰谱峰而影响测定[25]。

Biedermann 等[25]提出去除烯烃的方法，即采用间氯过氧苯甲酸（m-CPBA）将烯烃进行环氧化反应生成环氧物，增加烯烃的极性，延长其在液相色谱的洗脱时间，使其在MOAH 之后流出，从而达到分离、去除烯烃的目的。Nestola 等[26]对该方法进行了改进，将反应体系的溶剂从二氯甲烷换为乙醇，延缓了反应速率，使反应温度从冰浴升至室温，并且避免了溶剂转换，简化了反应步骤，此优化方法得到了Biedermann 等[26]的肯定。本文采用改进后的环氧化方法，去除奶粉中MOAH 的干扰物净化。

2.2 方法学考察

2.2.1 定量限 奶粉中矿物油的测定步骤包括皂化、提取、浓缩、洗涤、净化、环氧化等样品前处理步骤，然后注入HPLC-GC 同时测定MOSH 和MOAH的含量。通常需要考察新建检测方法的线性范围，然而，矿物油检测往往无需考虑这一点，原因是HPLC-GC 配备的检测器FID 范围非常宽，而HPLCGC 接口的限制，使得前面HPLC 分离流出的MOSH和MOAH 含量有限，远远达不到FID 的检测上限。因此，标准方法[18,27-28]均没有涉及线性范围，即只需考虑方法的下限（LOQ）即可。

无论是MOSH 还是MOAH 均为包含数以万计不同结构类型的混合物，GC 无法将它们分为单个化合物，因此，矿物油的谱图呈鼓包峰形状（图1）。然而，鼓包峰的灵敏度低[16]。为了满足分析不确定度要求，鼓包峰必须与基线拉开距离，形成足够高度，从而保证准确积分。目前LOQ 计算方法通常以进入GC 的矿物油质量须达到50～100 ng 计算[16]。本方法将5.0 g 奶粉样品中矿物油制备成近1 mL 试液，取其中的100 μL 分析，相当于HPLC-GC 测定0.5 g奶粉样品。因此，以100 ng 计算得到的定量限即为0.2 mg/kg。为了考察基线波动对鼓包峰的影响，本文分别测定了空白试验对应的MOSH 和MOAH含量，其数值分别低于0.12 和0.05 mg/kg，空白值应该小于LOQ 值得1/3[22]。

图1 DRRR 组织国际能力验证的奶粉样品（RVEP 2000612）中MOSH 和MOAH 的HPLC-GC 谱图Fig.1 HPLC-GC Chromatograms of MOSH and MOAH in the milk powder sample (RVEP 200612) from DRRR Proficiency Testing

本文综合考虑了矿物油多个前处理步骤造成的基线波动，不同碳数范围带来的鼓包峰高度差异，以及不同实验室的操作差异，确定方法的LOQ 值为0.5 mg/kg。

2.2.2 回收率和重复性 本文选取了两个市售奶粉，按照1.2.6 方法制备加标样品进行加标回收率实验。其中MOSH 部分添加了0.50～14.99 mg/kg 范围的多个水平，MOAH 部分则添加了0.58～2.22 mg/kg范围的4 个水平。结果表明，MOSH 的加标回收率达到81.1%～112.0%（RSD=0.3%～3.0%），MOAH的回收率为83.3%～93.1%（RSD=1.7%～3.8%），即方法学的各项指标均符合JRC 要求[19]（表3）。

表3 加标回收率考察结果（n=6）Table 3 Recoveries of spiked samples (n=6)

2.3 方法验证

为了进一步验证方法的准确性，本文测定了DRRR 组织国际能力验证的奶粉样品（RVEP 2000 612），结果见图1 和表4。此次验证样品的MOSH和MOAH 在C35～C50范围的含量极低（图1），因此主要考察C16～C25和C25～C35的MOSH 和MOAH 的含量及其z'比分数。其中z'比分数是用来衡量实验室测定值与参考值的偏离程度，如果z'比分数的绝对值低于2，则认为结果满意，通过验证[29-30]。

表4 DRRR 组织国际能力验证的奶粉样品（RVEP 200612）的MOSH 和MOAH（不同碳段）分析结果Table 4 Determination results of MOSH and MOAH (C-fraction) in the milk powder sample (RVEP 200612) from DRRR proficiency testing

本文分别采用文献的混合溶剂法[20]和本文所建方法进行了平行测试，均通过能力验证，证明这两种方法都能用于奶粉中低含量矿物油的测定。不过，相比混合溶剂法，尽管本方法的称样量增加至5 g（混合溶剂法的取样量只有2 g），但使用的溶剂量却较少（溶剂提取法约100 mL，本文所建方法约60 mL），说明本方法的灵敏度更高。

3 结论

本文建立了奶粉中MOSH 和MOAH 的高灵敏度分析方法，该方法的取样量为5.0 g，以温水分散后，依次通过皂化反应除去油脂，以正己烷萃取皂化液中的矿物油，进行洗涤和净化后，接着采用环氧化反应除去样品基质中的天然烯烃，最后注入HPLCGC 测定。该方法的灵敏度高，LOQ 达到0.5 mg/kg，回收率为81.1%～112.0%，应用该方法进行能力验证，其测定结果的z'比分数的绝对值小于2，满足欧盟最新的分析要求和限量规定。因此，本文建立的方法可以用于日常检测，也可以作为制定相关标准的参考方法。