基于SSR 标记的山茶属位点组合品种鉴别能力分析评价*

李丰钰 黄 平 郑勇奇, 李长红 张雨婷 薛克娜 宗亦臣 赵鸿杰

（1. 青岛农业大学园林与林学院 青岛 266109；2. 国家林业和草原局植物新品种分子测定实验室 国家林业和草原局林木培育重点实验室 中国林业科学研究院林业研究所 林木遗传育种国家重点实验室 北京 100091；3. 佛山市林业科学研究所 佛山 528234）

山茶属（Camellia）为常绿灌木或者小乔木，约有280 种，原产于东南亚，从喜马拉雅山到日本，从中国南部（广西和云南）到爪哇岛和苏门答腊岛均有自然分布（Liet al., 2021）。茶花（山茶花）是具有观赏价值的山茶属植物的统称，茶花主要包括山茶（Camellia japonica）、滇山茶（Camellia reticulata）、茶梅（Camellia sasanqua）、金花茶（Camellia nitidissima）等种及其品种，性状类型丰富，涵盖生长类型、花色、花型等观赏性状和耐寒、耐热、耐盐碱等适应性状。茶花因其具有较高的园艺观赏价值而在世界各地被广泛栽培，目前全球有记录的山茶属品种名超过5.1 万个（https://camellia.iflora.cn），随着植物育种的发展导致品种数量繁多，其中存在大量同物异名和同名异物的现象，部分品种间的性状差异较小，遗传背景相似，为品种的鉴别带来很大困难，不利于品种管理与保护，影响山茶属植物育种产业高质量发展（张亚利等, 2016，张旻桓等, 2018；潘丽芹等, 2019）。

由于山茶属品种观赏价值高，无性繁殖容易，可为育种者和生产者带来可观的经济利益，因此品种侵权时有发生，而品种鉴别和维权难度较大（陶乃奇等,2019）。目前山茶属品种鉴别主要采用基于形态性状的特异性、一致性、稳定性（DUS）测试方法（张晓庆,2008），利用分子标记技术鉴别山茶属品种尚处于研究阶段（申屠文月等, 2006；张景荣等, 2006）。DUS 测试存在成本高、周期长且易受环境和人为因素影响等问题，侵权证据难找、维权难度大，在处理品种侵权纠纷中的应用十分受限（李汝玉等, 2007）。SSR（简单序列重复）分子标记是国际植物新品种保护联盟（UPOV）推荐的可用于辅助植物品种鉴别的分子标记技术之一，SSR 分子标记具有操作简单、稳定性好、测试周期短、对DNA 质量要求不严等诸多优点，因此在植物品种鉴别上的应用日趋广泛（王玲玲等, 2017）。

已公布的SSR 分子标记位点在品种类群通用性、扩增结果重复性和位点多态性信息含量（polymorphism information content, PIC）等方面参差不齐并且差异较大，而多态性高、重复性好、通用性强等的SSR 位点是应用分子标记辅助植物品种鉴别的基础，因此SSR 分子标记位点的筛选尤为重要。前人对品种鉴别能力的分析评价往往是基于单个位点，而单个位点对品种的鉴别效率不高，多个位点组合可能会达到更好的品种鉴别效果，因此开展SSR 位点组合品种鉴别能力的分析评价研究十分必要。

基于累积鉴别力（TDP）是较为常用的评价分子标记位点组合的鉴别能力的统计方法（Jones, 1972），品种鉴别力（VDP）是新提出的可用于分析评价分子标记位点组合的品种鉴别能力的统计方法，具有无群体偏好，敏感度高等特点，其包括3 种评价植物品种鉴别力的统计方法：基于概率的品种鉴别力（P-VDP）、基于比较的品种鉴别力（C-VDP）和基于比率的品种鉴别力（R-VDP）。目前，该统计方法已在高粱（Sorghum bicolor）、 玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa）等农作物品种的分子标记位点组合品种鉴别能力分析评价工作中有初步应用（Yanget al., 2021）。

为了获得可用于山茶属品种鉴别和位点组合品种鉴别能力分析评价的SSR 分子标记位点，本研究搜集、整理了已公布的76 个山茶属SSR 分子标记位点，以山茶属品种为实验材料，包括红山茶组（Sect．Camellia）品种（84 个）、金花茶组（Sect．Chrysantha）无性系（27 个），其中红山茶组品种主要包含山茶和滇山茶，金花茶组无性系包含金花茶。结合位点多态性分析和位点组合VDP 分析的方法，筛选SSR 位点并对SSR 位点组合的品种鉴别能力进行分析与评价，旨在建立一套适用于山茶属品种分子鉴别的SSR 位点以及位点组合品种鉴别能力评价的体系，为品种鉴别及相关标准的制定等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用山茶属品种样品均取样于佛山植物园，选择生长状态良好、健康无病虫害的植株，共采取111 份山茶属品种新鲜嫩芽，置于装有硅胶的密封袋中，带回实验室彻底干燥后置于-80 ℃超低温冰箱中保存。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取及检测 采用高效植物基因组DNA提取试剂盒（型号：CW0531M，北京康为世纪）提取基因组DNA， 使用多功能酶标仪（SpectraMax i3,Molecular Device, Austria）检测DNA 的浓度和质量，1%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA 的完整性，检测合格的DNA 稀释至浓度为50 ng·µL-1，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 SSR 位点筛选 通过查阅文献，收集到山茶属已公布的76 个SSR 位点，选择55 个位点（PIC>0.5）进行初筛和复筛实验。初筛实验：以随机选取的8 个山茶属品种的DNA 作为模板，对55 个位点进行PCR 扩增，采用琼脂糖凝胶电泳对PCR 产物进行检测，选取条带清晰的位点进行荧光毛细管电泳，保留峰型正常、重复性好且多态性高的位点；复筛实验：利用初筛得到的SSR 位点侧翼引物对111 份茶花品种的DNA 进行PCR 扩增后，对其PCR 产物进行荧光毛细管电泳，筛选通用性高的位点（黄平等, 2012；任小平等, 2016；张晓宁等, 2016；赵瑞娟等, 2017；胡文斌等, 2020；刘超凡等, 2021）；最后，对111 份茶花品种的基因分型数据进行分析，选择观测等位基因数≥3 或PIC≥0.65 的位点（赵久然等, 2009）。

1.2.3 PCR 扩增和荧光毛细管电泳检测 在SSR 位点侧翼正向引物5′端加M13（TGTAAAACGACGGCC AGT）接头，构建TPM13-SSR 引物，M13 引物采用3种荧光（FAM、HEX 和ROX）标记。SSR 引物及M13荧光标记由北京美级思诺生物科技有限公司和北京睿博兴科生物技术有限公司合成。PCR 采用20 µL 体系：2×Taq MasterMix（10µL）；正向引物（0.5 µL）；反向引物（0.5 µL）； M13 引物（0.5 µL）； DNA（1 µL）；ddH2O（7.5 µL）。

PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s（温度见表1），72 ℃延伸30 s，20 个循环；94 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，15个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保温。PCR 扩增产物大小采用ABI 3730XL 测序仪检测。

表1 山茶属17 个SSR 位点多态性信息Tab. 1 Polymorphic information of 17 SSR loci in Camellia

1.2.4 SSR 位点组合品种鉴别能力分析评价 比较品种鉴别能力分析工具VDPTools（https://github.com/caurwx1/VDPtools.git）中4 种统计方法（TDP, P-VDP, CVDP, R-VDP）的敏感度，基于敏感度最高的统计方法分析评价筛选所得SSR 位点组合的品种鉴别能力（Yanget al., 2021），考虑到品种鉴别能力受组合的位点数和差异位点数等因素影响，进一步基于敏感度最高的统计方法，设置不同差异位点数，分析评价SSR位点组合分别对全部品种（系）、红山茶组品种、金花茶组无性系的品种鉴别能力，确定品种鉴别所需的最少SSR 位点数量的组合。

1.2.5 数据统计与分析 使用GeneMarker V2.2.0 进行基因分型（王蕊等, 2012），通过GenALEx 6.503 和Datatrans 2003 进行数据格式转换（盖红梅, 2011；Peakallet al., 2012）；使用Cervus 3.0.7 计算PIC 值（Zhouet al., 2022）；使用Popgen V1.31 计算观测等位基因数目（Na）（黄少勇等, 2013）；使用Excel 计算单位点基因型数和数据缺失率；使用Ntsyspc 2.10e 估算成对品种间的遗传相似系数（genetic similarity, GS），采用非加权类平均法（unweighted pair group method arithmetic averages, UPGMA）进行遗传聚类分析（Rohlf,1993）；使用VDPtools V1.0 评价SSR 位点组合的品种鉴别能力（Yanget al., 2021）。

2 结果与分析

2.1 SSR 位点筛选

通过琼脂糖凝胶电泳和荧光毛细管电泳筛选，初筛得到20 个带型正常、重复性好且多态性高的SSR位点，占筛选位点总数的36.4%；复筛得到17 个通用性强的SSR 位点，占筛选位点总数的30.9%，复筛得到的17 个SSR 位点对111 份茶花品种的基因分型结果显示峰型正常（部分基因分型结果见图1）。

图1 部分山茶属品种在p1 位点的基因分型Fig. 1 Genotyping of some Camellia varieties at p1 locus

2.2 SSR 位点多态性分析

以复筛得到的17 个SSR 位点对111 个山茶属品种的基因分型数据为基础进行多态性分析，分析结果显示，在17 个SSR 位点上共检测到166 个等位基因，观测等位基因数（Na）范围为3～15，均值为9.765，其中位点P06 的观测等位基因数最多（15 个），位点p41的观测等位基因数最少（3 个）；单位点基因型数量范围为6～35，均值为23.353 个，其中位点TUGM78 的基因型数最多（35 个），位点p41 的基因型数最少（6 个）；位点缺失率的范围为0～4.50%，均值为0.90%，其中位点p85 数据缺失率最高（4.50%）；多态性信息含量（PIC）的范围为0.447～0.835，均值为0.696，其中位点CSSR35 的多态性最低（0.447），位点p1 的多态性最高（0.835）（表1）。17 个SSR 位点均符合观测等位基因数≥3 或PIC≥0.65 的筛选要求，SSR 位点侧翼引物信息见表2。

2.3 山茶属品种（系）聚类分析

以最终确定的17 个SSR 位点对111 个山茶属品种的基因分型数据为基础，进行UPGMA 聚类分析，得到111 份茶花品种的聚类图（图2）。聚类结果显示，各品种间遗传相似系数在0.24～0.98 之间，111 个山茶属测试品种（系）在遗传相似系数为0.24 时，分为两类，一类是金花茶组无性系（27 个），另一类为红山茶组品种（84 个），结果表明SSR 位点可有效鉴别红山茶组品种和金花茶组无性系。

图2 基于遗传相似系数的111 个山茶属品种的UPMGA 聚类Fig. 2 UPMGA cluster of 111 Camellia varieties based on genetic similarity coefficient

2.4 四种统计方法的品种鉴别敏感度分析

差异位点数的设置和组合的位点数会影响品种鉴别能力，因此将4 种统计方法的差异位点数分别设置为1、2、3，比较不同统计方法计算的值对于组合中位点数量变化的品种鉴别敏感性。结果如图3 所示，总体上，不同差异位点数设置下，不同统计方法下的品种鉴别能力随着组合中SSR 位点数量的减少呈下降的趋势。其中，当差异位点数设置为1 时，R-VDP值显著降低（图3a）；当差异位点数设置为2 和3 时，RVDP 值和C-VDP 值显著降低，R-VDP 值降低更明显（图3b、3c），这表明随着差异位点数量的增加，RVDP 和C-VDP 均表现出了对组合位点数量变化的敏感性。而在4 种统计方法中，R-VDP 对于组合的位点数和差异位点数的变化最为敏感，与前人的研究结果一致（Yanget al., 2021），因此选择R-VDP 对SSR 位点组合的品种鉴别能力进行分析评价。

图3 差异位点数=1, 2, 3 时SSR 位点组合对全部品种（系）的鉴别力Fig. 3 When the number of differential loci=1, 2, 3,The discrimination of combination of SSR Loci to all varieties (lines)

2.5 不同差异位点数下SSR 位点组合品种鉴别力比较

如图4 所示，基于概率的品种鉴别力的值（RVDP 值）随着位点组合中SSR 位点数量的增加呈现上升的趋势，当位点增加到一定程度时，R-VDP 值也会达到最大值。如表3 所示，差异位点数=1 时，鉴别全部品种（系），最少需要11 个SSR 位点，占筛选所得SSR 位点总数的64.7%；鉴别红山茶组品种，至少需要10 个SSR 位点，占筛选所得SSR 位点总数的58.8%；鉴别金花茶组无性系，至少需要5 个SSR 位点，占筛选所得SSR 位点总数的29.4%（图4a）。差异位点数=2 时，17 个SSR 位点组合能够鉴别96.4%的全部品种（系），达到R-VDP 最大值最少需要12 个位点，占筛选所得位点总数的70.6%； 17 个SSR 位点组合能够鉴别95.2%的红山茶组品种，达到R-VDP 最大值最少需要12 个位点，占筛选所得位点总数的70.6%； 鉴别金花茶组无性系最少需要7 个位点，占筛选所得位点总数的41.2%（图4b）。差异位点数=3 时，17 个SSR 位点组合能够鉴别94.6%的全部品种（系），达到R-VDP 最大值最少需要8 个位点，占筛选所得位点总数的47.1%；17 个SSR 位点能够鉴别92.9%的红山茶组品种，达到R-VDP 最大值最少需要7 个位点，占筛选所得位点总数的41.2%，鉴别金花茶组无性系最少需要8 个位点，占筛选所得位点总数的47.1%（图4c）。如图5 所示，总体上R-VDP 值随着差异位点数的增加呈下降的趋势，当差异位点数≤6 时，17 个SSR 位点的组合对山茶属测试品种（系）群的R-VDP 最大值可保持相对稳定的状态。

图4 差异位点数=1, 2, 3 时SSR 位点组合在山茶属品种（系）群种的品种鉴别力Fig. 4 When the number of differential loci=1, 2, 3, variety discrimination power of combination of SSR Loci in Camellia variety (clones) groups

图5 17 个SSR 位点组合在不同差异位点数下对山茶属品种（系）群的品种鉴别力比较Fig. 5 Comparison of variety discrimination power of combination of SSR Loci under different number of differential loci in Camellia variety (clones) groups

表3 SSR 位点组合在不同山茶属测试品种（系）群中的品种鉴别力分析评价Tab. 3 Analysis and evaluation of variety discrimination power of combination of SSR loci in different variety (clone) groups of Camellia

3 讨论

3.1 SSR 位点筛选及评价

本研究筛选验证获得了17 个SSR 位点，约占筛选位点总数的30.9%。通过比较分析发现，SSR 标记单位点PIC 范围介于0.447~0.835 之间，与玉米较为接近（0.463~0.852）， 高于水稻（0.370~0.810）、 小麦（Triticum aestivum）（0.240~0.829），单位点的等位基因数量也与玉米较为接近，略高于水稻，低于小麦（田大刚等, 2013；郑永胜等, 2014；赵文明等, 2018），多态性信息含量、等位基因数量等指标都是反映群体遗传变异大小的指标，与位点遗传特征，测试群体大小、群体遗传背景等因素有关，比较分析结果也表明本研究筛选获得的山茶属SSR 标记在单位点水平具有良好的多态性，可作为品种鉴别的遗传分析工具。基于SSR分子标记的聚类分析结果表明利用这些标记可较好的区分山茶属不同类群的品种（系），可作为植物品种分组管理的有效工具。

3.2 统计方法的选择

统计方法的敏感性分析是分子标记位点组合品种鉴别力分析评价的重要指标，在山茶属SSR 分子标记组合分析评价中，我们发现在不同差异位点数设置下，R-VDP 值对组合位点数的变化均表现出较好的敏感性，其次是C-VDP，当差异位点数≥2 时，C-VDP 对组合位点数的变化也有表现出一定的敏感性，但RVDP 对组合位点数变化和差异位点数变化的敏感性均优于C-VDP，更有利于组合位点品种鉴别力的分析评价，尽管如此，R-VDP 对于缺失数据的稳定性比CVDP 差（Yanget al., 2021），因此R-VDP 应用的前提条件是筛选所得位点具有较低的数据缺失率，本研究中筛选获得的SSR 位点在测试品种中的数据缺失率均小于0.05，因此选择了R-VDP 对位点组合进行了分析评价。在品种鉴别实际应用中，当筛选所得位点的数据缺失率较高、品种鉴别灵敏度不重要且鉴别标准为差异位点数≥2 时，也可选择C-VDP 对位点组合品种鉴别能力进行分析评价。

3.3 SSR 位点组合品种鉴别力分析评价

在品种鉴别实践工作中，通常会使用SSR 位点组合对测试品种进行鉴别，因此，筛选鉴别能力较好的位点组合是建立植物品种鉴别标准方法的重要工作之一。之前的很多研究都是基于单位点水平的品种鉴别能力筛选标记位点，VDP 方法不仅可分析评价位点组合的品种鉴别能力，还可用于确定达到最高品种鉴别力所需的最少位点的组合，可达到缩减位点检测数量与保持鉴别能力的平衡。在本研究中，使用了RVDP 的统计方法对山茶属SSR 位点组合进行了综合评价，在不同差异位点数的设置下，山茶属SSR 位点组合在不同山茶属测试品种（系）群中均表现出较好的品种鉴别能力。以差异位点数=2 为例，山茶属品种的R-VDP 最大值要高于高粱、玉米，且使用了更少的SSR 位点数量，这也表明筛选获得的SSR 标记组合具有较强的品种鉴别能力（Yanget al., 2021）。SSR 位点组合的鉴别能力也与物种育种进程、技术方法，品种遗传近似程度等因素有着密切的联系，尽管山茶属的品种育种历史悠久，品种数量巨大，但木本植物杂合度高，遗传背景复杂的特点，也一定程度的提升了品种鉴别的效率。在品种鉴别工作中，鉴别能力往往与位点组合的数量成正相关，一般认为，检测位点越多，鉴别能力越强，鉴别结果越可靠，但在品种鉴别实践中还需要考虑与测试成本间的平衡。本研究基于已有的测试品种群，通过计算不同数量位点组合的品种鉴别力，确定了品种鉴别所需的最少位点数量，获得了具有高效鉴别能力的位点组合。例如，差异位点数=2 时，对于所有测试品种，17 个SSR 位点组合RVDP 最大值为0.964，达到R-VDP 最大值最少需要12个位点的组合，占筛选所得位点总数的70.6%。

3.4 SSR 位点组合品种鉴别力分析评价的实际应用——品种鉴别

分析评价SSR 位点组合品种鉴别力，不仅能有效评估SSR 位点的组合的品种鉴别能力，还可提高品种鉴别效率，为品种鉴别及相关标准的制定等奠定基础。提高品种鉴别效率意味着利用较少的SSR 位点、较短的测试时间和较低的经济成本达到较高的品种鉴别能力。为了提高品种鉴别效率，达到缩减位点数量和保持鉴别能力的平衡。在品种鉴别实践中，理论上应优先选用具有较强鉴别能力的位点组合。在已发布的基于SSR 分子标记的品种鉴别的系列标准中，通常认为差异位点数≥2 可判定为不同品种，在红山茶组品种中，12 个SSR 位点的组合和17 个SSR 位点的组合具有相同的品种鉴别效果，因此当被侵权品种为红山茶组品种时，建议优先选择12 个位点的组合进行鉴别侵权与被侵权品种，其余位点可作为备选检测位点。在金花茶组无性系中，7 个SSR 位点的组合和17 个SSR 位点的组合具有相同的品种鉴别效果，因此当被侵权品种为金花茶组无性系时，建议优先选择7 个位点的组合进行鉴别工作，其余位点可作为备选检测位点。

3.5 SSR 位点组合品种鉴别力分析评价的实际应用——品种鉴别标准制定

品种鉴别标准是判定两个品种相同或者不同的标准，例如差异位点数量、差异位点比率或者遗传距离等，设定品种鉴别标准要综合考虑物种或者品种的遗传背景、育种现状等因素（Heckenbergeret al., 2002；Achardet al., 2020）。本研究以差异位点数为例，分析不同鉴别标准下山茶属SSR 位点组合对于3 个山茶属品种群的品种鉴别力的影响。理论上差异位点数越多，则两个品种间遗传差异越大，判定为不同品种的可能性也就越大。在现行品种SSR 分子鉴别的国家/行业标准中，一般将差异位点数设置为1、2 或者3，例如白蜡属（Fraxinus）、油茶（Camellia oleifera）等标准中认为当两个品种的差异位点数为1 时，即可判定为不同品种（国家林业局, 2014；国家林业和草原局,2019）；而在高粱、玉米、水稻、枣（Ziziphus jujuba）、花生（Arachis hypogaea）等标准中认为当两个品种间的差异位点数≥2 时，才能判定为不同品种，两个测试品种之间如果差异位点数=1 时，则认为是相近品种，当差异位点数=0 时，认为是极为近似品种或者相同品种（中华人民共和国农业部, 2013a；中华人民共和国农业部, 2014a; 2014b；国家林业局, 2015；山东省市场监督管理局, 2019）；在小麦、紫苏等标准中认为两个品种间差异位点数≥3 时,判定为不同品种，品种间差异位点数=1 或2 时,判定为相近品种，品种间差异位点数=0 时,判定为极近似品种（中华人民共和国农业部,2013b；贵州省市场监督管理局, 2020）。因此本研究将差异位点数分别设置为1、2、3，分析不同差异位点数设置下山茶属SSR 位点组合对于全部品种（系）、红山茶组品种、金花茶组无性系鉴别力的影响。结果表明：将差异位点数分别设置为1、2、3 时，17 个位点的组合对山茶属品种（系）群均具有良好的品种鉴别能力（见图4a–c），当差异位点数≤6 时，17 个SSR 位点的组合对山茶属品种（系）群的品种鉴别力最大值可保持相对稳定的水平，表明筛选所得SSR 位点用于山茶属品种鉴别的差异位点数最大可设置为6（见图5），这也可为研制基于SSR 分子标记法的山茶属品种鉴别标准的设置提供重要的参考依据。