固相萃取-液相色谱/质谱法测定坚果中7种真菌毒素

袁光蔚，莫紫梅，王海波，李锐，韦兰青

广西-东盟食品检验检测中心（南宁 530025）

坚果是一类具有坚硬外壳的植物果实，其风味独特，并含有大量功能性生物活性成分，具有抗衰老、预防糖尿病、减肥等多重保健作用，备受消费者青睐[1-2]。然而，坚果在整个生长周期以及生产、加工、贮藏、销售过程中极易受真菌侵染，产生并积累多种毒性代谢产物，这些毒素大多具有致畸、致癌、致突变等毒性，给食品安全及人类健康造成巨大的安全隐患[3]。

鉴于真菌毒素的危害，许多国家和地区均制定了严格的限量标准和检测方法[4-5]。在真菌毒素的检测技术中，基于免疫学的快速筛查技术体系已基本建成[6-8]，在精准定量检测方面，液相色谱法作为当前实验室的主流检测技术，特别是与质谱技术的联用，凭借其强大的分离能力和较高的灵敏度、准确性、稳定性，成为当前真菌毒素检测领域最为可靠的检测技术[9-17]。研究在相关文献中真菌毒素提取、净化技术的基础上，分别以板栗和核桃作为淀粉类坚果和油性坚果的代表基质[18]，综合对比了几款针对性较强的固相萃取小柱及QuEChERS技术的前处理效果，并结合UPLC-MS/MS的优势，建立了坚果中较易受污染、国内外关注度较高且毒性较强的7种主要真菌毒素的检测方法，以期为坚果中真菌毒素的质量控制提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

样品分别购自广西区内农贸市场、超市等。

黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2（AFB2）、黄曲霉毒素G1（AFG1）、黄曲霉毒素G2（AFG2）混合标准溶液（AFB1、AFG2=0.3 μg/mL，AFB2、AFG2=1.0 μg/mL）（上海安谱璀世标准技术服务有限公司）；赭曲霉毒素A（OTA）（10.05 μg/mL，美国o2si smart solutions公司）；T-2（100 μg/mL，北京曼哈格生物科技有限公司）；玉米赤霉烯酮（ZEN）（1 120 μg/mL，德国Witega公司）。

Anybond SinCHERS-Myco14 净化小柱（Myco14，天津安邦键合科技有限公司）；MFC 100固相净化柱[MFC100普瑞邦（北京）科技有限公司]；Mycosep®228多功能净化柱（简称Mycosep228，美国ROMER公司）；QuEChERS基质分散样品制备包（4 g硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠，美国Waters公司）；分散型SPE净化包（150 mg MgSO4，50 mg PSA和50 mg C18；货号：60105-204，美国赛默飞公司）。

甲醇、乙腈（色谱纯，德国默克公司）；甲酸（色谱纯，美国赛默飞公司）；乙酸铵（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

MS3002SE 电子天平（美国梅特勒-托利多METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Milli-pore公司）；KS260多管式涡旋震荡器（德国 IKA公司）；S300H型超声清洗仪（德国Elma公司）；ROTANTA460/460R型离心机（德国Hettich公司）；ACQUITY I-Class高效液相色谱仪（美国Waters公司）；TQ-XS质谱仪[配有电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI）及Masslynx 4.2工作站，美国Waters公司]。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

样品经粉碎，过0.425 mm筛后，混匀备用。称取5 g样品于50 mL离心管中，准确加入20 mL乙腈-甲酸-水（84∶1∶15，V/V）混合提取液，超声或者剧烈振荡20 min，插入Myco14专用净化小柱（小柱使用演示图和实际操作图见图1上），下压小柱至小柱内压出2 mL液体，将小柱内净化液体混匀，经0.22 μm有机滤膜过滤到进样小瓶中，上机测定。

图1 净化小柱使用演示图（上为Myco14小柱，下为MFC100、Mycosep228小柱）

1.3.2 标准溶液配制

空白基质溶液：取未检出目标物的板栗、核桃空白样品，按1.3.1小节进行处理，得空白基质滤液。

混合标准溶液配制：将各原始标准物质分别用乙腈溶解或稀释，摇匀备用；分别准确吸取7种真菌毒素标准溶液适量于容量瓶中，用乙腈定容，摇匀即得。

基质匹配混合工作曲线溶液：取空白基质溶液将混合标准溶液逐级稀释，配制成浓度比例为1∶2∶4∶10∶20∶40的系列混合工作曲线溶液。

1.3.3 液相色谱条件

色谱柱：Waters CORTECSTM® UPLC® C18柱（1.6 μm，100 mm×2.1 mm）；柱温40 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量2 μL；流动相A为含0.1%（体积分数）的甲酸和1 mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B 为甲醇。梯度洗脱条件：0～0.5 min，90% A；0.5～6.0 min，90% A～50% A；6.0～7.0 min，50% A；7.0～9.0 min，50% A～5% A；9.0～12.0 min，5% A；12.0～12.1 min，5% A～90% A；12.1～15.0 min，90% A。

1.3.4 质谱条件

离子源：ESI源；扫描方式：正离子；检测模式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：150 ℃；干燥气温度：500 ℃；雾化气压力：7.0 Bar；干燥气流量：1 000 L/hr；气帘气流量：150 L/hr。

PIC参数：激活阈值：20倍背景；最小激活：5 000个计数点；重置阈值：50%激活值；质量范围：10 Da以上；最小质量：40 Da；数据类型：棒状图；PIC持续时间：1秒。碰撞能量（eV）：与化合物所选定量离子碰撞能一致。

2 结果与分析

2.1 液相条件和质谱条件的确定

色谱柱、流动相、柱温见文献[19]。因为此次试验采集的化合物较少，故洗脱梯度在参考文献的基础上进行了调整，缩短了洗脱时间，节省了分析时间，各化合物保留时间见表1。

表1 7种真菌毒素的质谱参数

取混合标准溶液直接进样，利用Q1 MS Scan扫描模式确定各目标物的最佳电离模式以及加合形式；利用Q2 MS/MS Daughter Scan扫描模式将母离子打碎，得到二级碎片离子，结合Mass Frontier 7.0软件推测的化合物可能的质谱转换裂解途径，确认其二级特征碎片离子[19]，选择响应较高的两个离子分别为定量离子和定性离子。试验发现，除T-2响应最强分子离子峰为[M+NH4]+外，其余均为[M+H]+，7种化合物质谱参数见表1，MRM图谱见图2。PIC，即Product Ion Confirmation（产物离子确认），当目标离子的响应达到设定的阈值时，即可触发一次Daughter Scan模式进行数据采集，在进行复杂基质中痕量毒素的检测时增加一种确证的手段，降低假阳性的风险。

图2 7种真菌毒素提取离子色谱图

2.2 前处理方法的研究

2.2.1 提取溶剂的考察

目前，真菌毒素一般选择有机溶剂和水的混合溶液进行提取，甲醇和乙腈作为最常用的两种有机溶剂，甲醇虽比乙腈具有更好的溶解性，但也易将样品中的有机酸、蛋白质、脂肪、酚等物质提取出来，导致提取液中杂质较多，不利于后续净化、分析，而乙腈对蛋白质的沉淀作用较强且共提物少，因此乙腈作为首选。物质的解离度跟其pKa值和环境pH有直接关系[20]，提取溶剂的pH会显著影响真菌毒素的解离状态，进而影响其回收率。此次研究中OTA为含羧基毒素，以QuEChERS方法对不同提取溶剂进行优化时发现，当提取溶剂中加入1%的甲酸时，OTA在两种基质中的回收率由不加酸时的1%～5%提升到93%～97%，应该是甲酸能使溶剂保持较低pH，进而抑制目标物的离子化，使其更易溶于有机相，达到增高提取效率和保持稳定回收率的效果，同时，参考文献[11,21]，最终确定提取溶剂为乙腈-甲酸-水（84∶1∶15，V/V）。

2.2.2 净化方式的确定

此次研究主要通过回收率指标分别考察Myco14、MFC100、Mycosep228净化小柱及QuEChERS的净化效果。（1）Myco14净化小柱：见1.3.1小节；（2）MFC100、Mycosep228：样品经粉碎，过0.425 mm筛后，混匀备用；称取5 g样品于50 mL离心管中，准确加入20 mL乙腈-甲酸-水（84∶1∶15，V/V）混合提取液，超声或者剧烈振荡20 min，按4 600 r/min离心5 min，取4 mL上清液至配套玻璃管中，然后用小柱推压至液体全部通过，混匀，经0.22 μm有机滤器过滤即得（小柱使用演示图见图1下）；（3）QuEChERS：在文献[22]的基础上进行了适当改进，称取2 g样品，加入20 mL乙腈-甲酸-水（84∶1∶15，V/V）混合提取液，振荡提取20 min，加入QuEChERS基质分散样品制备包，涡旋1 min，离心，取1.5 mL上清液，加入分散型SPE净化包，涡旋1 min，离心，经0.22 μm有机滤器过滤即得。

试验过程发现，在以板栗为基质进行研究时，经MFC100、Mycosep228、QuEChERS处理的滤液，均呈现不同程度的黄色，可直观看出净化效率欠佳，可对后续测定的色谱、质谱系统造成污染，而以核桃为基质进行研究时，各滤液均为澄清。如图3所示。

图3 4种净化方式的净化效果（上为板栗基质，下为核桃基质）

取板栗、核桃空白样品，加入适量混合标准溶液，分别按上述前处理步骤进行处理，得各前处理方法回收溶液。然后取各方法空白基质溶液稀释混合标准溶液至恰当浓度，利用单点法分别考察其前处理方法的回收率，结果见图4和图5。对回收率数据进行统计分析，Myco14净化小柱在两种基质中的回收率为83%～106%，所有化合物均有较好的回收率。MFC100净化小柱在两种基质中的回收率为48%～115%，回收率在70%～80%之间的占比为64%，回收率低于60%的化合物是OTA，分别为48%和50%。Mycosep228净化小柱在两种基质中的回收率为0～121%，除OTA的回收率为0外，其余化合物回收率均大于87%。取适量混合标准溶液直接过各款净化小柱，结果发现MFC100、Mycosep228对OTA具有极强的吸附作用，吸附率分别高达99.3%和97.2%，但可能由于共提取杂质和填料之间的相互作用，使得在OTA在MFC100中的回收率仍有50%左右。QuEChERS前处理对板栗基质进行考察时回收率为83%～104%，而在核桃基质中的回收率仅为48%～104%，AFBs类化合物回收率普遍较低，为48%～70%，应该是因为试验中净化材料对油脂性基质适用程度不高。因此，此次研究最终选择以Myco14为净化小柱进行下一步的方法学研究。

图4 4种净化方式在板栗基质中回收率统计

图5 4种净化方式在核桃基质中回收率统计

2.3 方法学研究

2.3.1 基质效应

基质效应是ESI源受离子化机制的影响，目标物与共流出物产生竞争性电离，导致目标物响应增强或者降低的现象，通常以目标物在空白基质液中的峰面积与在纯溶剂中峰面积的百分比来评估基质效应。高于100%说明有基质增强效应，低于100%则说明有基质抑制效应。为降低或消除基质效应的影响，通常的手段是采用稳定同位素稀释法或基质加标曲线法进行定量[19]。试验结果显示：目标物在板栗中的基质效应为81%～102%，主要为基质抑制效应；在核桃中基质效应为85%～97%，基质效应不明显。考虑到坚果基质的多样性，研究仍采用基质加标曲线法进行定量计算。

2.3.2 方法的线性及范围

将基质匹配混合工作曲线溶液上机检测，以待测化合物定量离子峰面积对其浓度进行线性拟合，获得各目标物的线性方程。7种化合物在各自浓度区间范围内线性关系良好，相关系数r均大于0.996，各具体数据见表2和表3。

表2 7种化合物在板栗基质中的线性范围、线性方程、定量限及在三个不同加标浓度水平下的回收率与相对标准偏差（SRSD）

表3 7种化合物在核桃基质中的线性范围、线性方程、定量限及在三个不同加标浓度水平下的回收率与相对标准偏差（SRSD）

2.3.3 检出限、准确度和精密度

试验采用逐级稀释空白加标样品至仪器能检出的最低含量为各化合物的检出限，并以检出限的3倍量为方法定量限。取板栗、核桃空白样品，进行了曲线最低点（低水平：加标量为1.5～28 μg/kg）、曲线第二低点（中水平：加标量为3.0～56 μg/kg）、曲线第三低点（高水平：加标量为6～112 μg/kg）浓度水平的加标回收试验，每个浓度水平平行测定6份样品，同时对回收率精密度进行考察，回收率在80%～107%之间，SRSD为0.7%～4.9%，表明该方法具有良好的准确性和精密度，具体结果见表2和表3。

2.3.4 样品检测

采用试验方法对购自广西区内农贸市场和超市的板栗、核桃、巴旦木、开心果、腰果、碧根果、花生共35批样品（每种坚果5批）进行检测，其中1批花生检出了AFB1，含量为1.48 μg/kg，符合GB 2761—2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》[23]的要求，其余均未检出。可见虽然市售坚果中存在一定的真菌毒素污染风险，需给予持续关注，但是整体状况还是相对安全的，可放心购买、食用。

2 结论

研究以代表性较强的板栗、核桃为基质，通过考察了Myco14等三款毒素专用小柱和QuEChERS技术的提取、净化效果，建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱测定坚果中7种常见真菌毒素的检测方法，经验证，方法检出限、准确度、精密度等方法学指标均能达到确证检测和痕量分析的要求。该方法前处理所采用的挤压通过式固相萃取小柱较传统的保留、洗脱模式固相萃取小柱更为简便、高效，净化效果较QuEChERS技术更为彻底，仪器检测手段灵敏、准确、稳定，可为市场监管部门和坚果生产经营企业对坚果风险的监测和评估提供有效的技术手段。