蒙药赤瓟子的提取及其镇痛抗炎作用的实验研究

2023-10-19唐晓光刘倩陈晓北张聪颖

赤峰学院学报·自然科学版 2023年9期

唐晓光刘倩陈晓北张聪颖

摘要：目的：采用响应面法优化赤瓟子的提取工艺，评价蒙药赤瓟子乙醇提取物的鎮痛抗炎活性。方法：采用单因素试验考察提取时间、提取温度、液料比、乙醇浓度对赤瓟子提取率的影响，依据Box-Behnken组合设计，确定其最佳提取工艺。采用热板法和扭体法考察赤瓟子乙醇提取物的镇痛活性，采用二甲苯致小鼠耳肿胀法和鸡蛋清致大鼠足肿胀法考察赤瓟子乙醇提取物的抗炎活性。结果：赤瓟子最佳提取工艺，液料比、乙醇浓度、提取时间、提取温度分别为15：1ml/g、68%、1h和80℃。蒙药赤瓟子乙醇提取物能显著延长小鼠的痛阈值和扭体的潜伏期，显著降低冰乙酸诱发的小鼠扭体次数，显著抑制鸡蛋清所致的大鼠足肿胀和二甲苯所致的小鼠耳肿胀。结论：蒙药赤瓟子乙醇提取物具有显著的镇痛抗炎活性。

关键词：蒙药，赤瓟子；镇痛；抗炎

中图分类号：R285.5；R289.5 文献标识码：A 文章编号：1673-260X（2023）09-0063-05

赤爮子蒙药名为敖乐木色，为葫芦科植物赤瓟Thladiantha dubia Bunge的干燥成熟果实，又名赤雹、气包、山屎瓜等，广泛分布于内蒙古、东北三省、华北、陕西等地，性甘、酸、平，具有活血、化瘀、调经之功效，常用于阴道疾病、血瘀宫中、血痞、经闭、皮肤病等的治疗[1]。赤瓟子作为民族药，不仅作为蒙药使用，还在满族民间应用，常用来治疗多种疼痛，如腰腿痛、痛经、风湿痛、乳房胀痛等[2]。研究发现，赤瓟子具有显著的抗炎活性[3]。目前关于赤瓟子的报道主要集中于赤瓟子水提物或其中某类成分的单一药理作用，而其乙醇提取物的镇痛抗炎活性报道较少。本研究通过热板法、扭体法评价赤瓟子乙醇提取物（CPZE）的镇痛活性，采用二甲苯和鸡蛋清致炎法评价CPZE的抗炎活性，为蒙药赤瓟子的临床合理应用和药物的研发提供参考依据。

1 实验材料和动物

1.1 实验动物

昆明种小鼠，雌雄各半，SPF级，体质量范围20±2g；SD大鼠，雌雄各半，体质量范围200～220g，大鼠和小鼠均由北京科宇动物养殖中心提供，动物合格证号为SCXK（京）2018-0010。采购实验动物后，先进行适应性喂养7天，饲养环境：饲养温度20～24℃，相对湿度（55±5）%，通风良好，明暗适宜。

1.2 实验仪器

数显水浴锅（HH-2，江苏恒隆）；旋转蒸发仪（RE-2000E，上海尚仪）；循环水真空泵（SHZD-III，河南予华）；超声波清洗机（KQ-250E，昆山舒美）；电子天平（美国，梅特勒AE240）；智能热板仪（成都泰盟科技，ＲB-200）；6mm打孔器；数显游标卡尺；灌胃针，注射器等。

1.3 药品与试剂

赤瓟子（本品为自采药用植物，经赤峰学院王洪侠副教授鉴定为赤瓟子的成熟果实），阿司匹林泡腾片（产品批号：1911168，阿斯利康），冰乙酸（产品批号：20120808，国药集团，分析纯），二甲苯（产品批号：20180203，天津天力，分析纯），95%乙醇（盘锦天源，分析纯），10%鸡蛋清溶液（现用现配，溶剂为生理盐水），无菌蒸馏水（实验室自制），生理盐水等。

1.4 实验分组及给药剂量

热板法、扭体法、二甲苯致耳肿胀实验分组：取小鼠80只，雌雄各半（热板法全部用雌性小鼠），随机分成阳性对照组（阳性药为阿司匹林）、CPZE高剂量组、中剂量组、低剂量组和空白对照组，以上5组给药剂量分别为0.03g·kg-1、6g·kg-1、3g·kg-1、1.5g·kg-1和对应浓度等体积的生理盐水。鸡蛋清致大鼠足肿胀实验分组：取SD大鼠72只，雌雄各半，随机分6组，在上述分组基础上增设模型组，空白对照组和模型组给予对应浓度同等体积的生理盐水，CPZE高剂量组、中剂量组和低剂量组给药剂量应根据小鼠给药剂量、大鼠体质量换算成大鼠的给药剂量，阳性对照组阿司匹林给药剂量为人临床极量根据大鼠体质量换算成大鼠的给药剂量。

2 赤瓟子提取工艺实验方法

2.1 赤瓟子提取工艺的优化

2.1.1 药材预处理

赤瓟子打碎过60目筛，在烘箱内恒温干燥24h，直至重量不再变化。

2.1.2 赤瓟子的提取

称量赤瓟子20g，加适量乙醇浸泡24h，回流提取2次，提取液减压蒸馏至恒重，按下列公式计算浸膏质量和提取率（%）。

浸膏质量（g）=蒸馏后圆底烧瓶（含浸膏）的质量（g）-蒸馏前圆底烧瓶的质量（g）

提取率（%）=（浸膏质量÷20g）×100%

2.1.3 单因素试验

取赤瓟子粗粉80g，平均分成4份，通过单因素试验评价提取温度、提取时间、料液比和乙醇浓度对赤瓟子提取率的影响。提取温度对赤瓟子提取率的影响：按照液料比15：1mL/g加一定浓度的乙醇，设定5个提取温度（50℃、60℃、70℃、80℃、90℃），每个温度下提取2次，每次提取1h，每个温度下实验重复2次，计算平均提取率。提取时间对赤瓟子提取率的影响：按照液料比15：1mL/g加一定浓度的乙醇，选择7个不同的提取时间（30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min），在80℃下回流提取，提取次数、实验重复次数和提取率计算同上。液料比对赤瓟子提取率的影响：选择6个不同的液料比，加70%的乙醇，在80℃下回流提取1h，提取次数、实验重复次数和提取率计算同上。乙醇浓度对赤瓟子提取率的影响：按液料比为15：1mL/g，选择5个不同浓度的乙醇为提取溶剂，即50%、60%、70%、80%、90%，在80℃下回流提取1h，提取次数、实验重复次数和提取率计算同上。

2.2 赤瓟子乙醇提取物的制备

称量干燥赤瓟子粗粉500g，加2倍量68%乙醇浸泡24h，用15倍量的68%乙醇在80℃下回流提取2次，每次提取1h，趁熱过滤，合并提取液，置旋转蒸发仪中减压蒸馏，回收乙醇，蒸至浸膏恒重，称量适量的CPZE，将其稀释成6g·kg-1、3g·kg-1、1.5g·kg-1的溶液，即为CPZE的高剂量组、中剂量组和低剂量组。

2.3 热板法

根据《药理实验方法学》中记录的方法[4]，取智能热板仪，设置温度为（55±0.5）℃，待温度恒定后，将小鼠置于热板仪中，观察并记录小鼠第一次添后足的时间，该时间即为小鼠的痛阈值。筛选痛阈值在5～30s内的雌性小鼠（即痛阈合格的小鼠）80只，分组及给药剂量见“1.4”，每日1次，连续灌胃7d。首次给药前，在热板仪上重复测量两次痛阈值，平均值作为各组小鼠的基础痛阈值。给药后1h、1.5h、2h再测各组小鼠痛阈值，若小鼠痛阈值超过60s，应立刻将小鼠取出或停止热板实验，此时痛阈值按60s计算。

2.4 扭体法

取小鼠80只，分组及给药剂量见“1.4”，每日1次，连续灌胃7d，于末次给药1h后，各组小鼠分别腹腔注射1.5%的冰乙酸0.2ml，观察并记录小鼠从注射冰乙酸后第一次出现扭体反应（小鼠腹部收缩内凹、伸展后肢、臀部抬高、蠕行）的时间（即扭体潜伏期）和注射15min内小鼠的扭体反应次数[4，5]，并按下列公式计算扭体抑制率。

扭体抑制率（%）=（空白对照组小鼠扭体次数-给药组小鼠扭体次数）/空白对照组小鼠扭体次数×100%

2.5 鸡蛋清致大鼠足肿胀法

取SD大鼠72只，分组及给药剂量见“1.4”，每日1次，连续灌胃7d，于末次给药1h后，在大鼠右后足掌中心皮下注射10%鸡蛋清生理盐水溶液0.1ml造急性炎症模型，分别在致炎前和致炎后0.5h、1h、2h测量并记录各大鼠右后足趾固定位置的厚度，按下列公式计算足肿胀度[6]。

足肿胀度（cm）=致炎后足趾厚度（cm）-致炎前足趾厚度（cm）

2.6 二甲苯致小鼠耳肿胀法

取小鼠80只，分组与给药剂量见“1.4”，每日1次，连续灌胃7d，于末次给药1h后，于小鼠左耳正反面均匀涂抹二甲苯0.05mL致炎，右耳不涂二甲苯。致炎0.5h后，将小鼠处死，剪下小鼠的左右两耳，在左耳致炎的部位和右耳同一位置做好标记，用打孔器在做好标记的位置上打下圆耳片，随即用电子天平精密称量左右圆耳片的重量，记录并计算小鼠耳廓肿胀度和肿胀度抑制率[7]。

肿胀度（mg）=左耳重量（mg）-右耳重量（mg）

肿胀抑制率（%）=（空白对照组小鼠耳肿胀度-给药组小鼠耳肿胀度）/空白组小鼠耳肿胀度×100%

2.7 统计学分析

采用spss25.0软件进行统计学分析，数据以均数加减标准差（x±s）表示，组与组之间的比较采用方差分析法处理。

3 实验结果

3.1 响应面法优化赤瓟子提取工艺

根据Box-Behnken中心组合设计，采用响应面法确定出了蒙药赤瓟子的浸膏提取率最高的条件，即最佳提取工艺为：液料比、乙醇的浓度、提取的时间、提取的温度分别为15：1ml/g、68%、1h、80℃。

3.2 对小鼠痛阈值的影响

赤瓟子乙醇提取物对小鼠痛阈值的影响结果见表1。研究结果表明，与空白对照组相比，CPZE中剂量组和阳性对照组小鼠的痛阈值随着时间的推移显著增加（P<0.01），而CPZE低剂量组和高剂量组小鼠的痛阈值显著增加（P<0.05）。与阳性对照组相比，CPZE中剂量组小鼠的痛阈值差异具有显著性（P<0.01），虽然CPZE比阿司匹林的镇痛活性略低，但仍然表现出较强的镇痛活性。CPZE的镇痛强度与剂量呈一定相关性，即在一定范围内，CPZE的镇痛强度随着剂量的增加而增大。由表1可知，各组小鼠（空白对照组除外）痛阈值均在1.5h达到了峰值，换言之，1.5h CPZE的镇痛活性最强，随后各组小鼠痛阈值呈缓慢下降趋势。

3.3 对冰乙酸诱发小鼠疼痛的影响

赤瓟子乙醇提取物对冰乙酸诱发小鼠疼痛的影响结果见表2。研究结果表明，与空白对照组相比，阳性对照组和CPZE高剂量组小鼠的扭体潜伏期延长显著（P<0.01），扭体次数显著降低（P<0.05）；CPZE中剂量组小鼠的扭体潜伏期显著延长（P<0.05），扭体次数显著减少（P<0.05）；CPZE低剂量组小鼠的扭体反应潜伏期没有明显变化，但该组小鼠扭体次数降低较为显著（P<0.05）。从各组（空白对照组除外）对冰乙酸诱发小鼠疼痛的抑制率来看，阳性药阿司匹林的抑制率最高，其扭体抑制率为61.86%，CPZE高剂量组、中剂量组的抑制率分别为55.37%和36.19%，CPZE低剂量组抑制率最低，抑制率只有19.43%，由此可知，镇痛作用的强弱次序为：阿司匹林>赤瓟子高剂量组>赤瓟子中剂量组>赤瓟子低剂量组。由表2可知，一方面，CPZE的镇痛强度随着剂量的增加而逐渐增加，即呈现出一定的剂量依赖性；另一方面，CPZE高剂量组的镇痛作用与阿司匹林相比，虽然有差距，但并不大。

3.4 对鸡蛋清致大鼠足肿胀的影响

赤瓟子乙醇提取物对鸡蛋清致大鼠足肿胀的影响实验结果见表3。研究结果表明，与模型组相比，CPZE高、中、低剂量组和阳性对照组对大鼠足趾的局部炎症均有显著抑制作用（P<0.05/P<0.01），CPZE各剂量组和阳性对照组大鼠足肿胀程度明显降低（P＜0.01），从0.5h以后均发挥了显著的抗炎作用，且阳性对照组对大鼠炎症的抑制活性最强；与空白组相比，模型组大鼠足肿胀度增加明显（P＜0.01），从致炎0.5h后，各组大鼠足肿胀度均达到了峰值，随后足肿胀度呈下降趋势；在0.5h、1h、2h CPZE各剂量组对大鼠足趾肿胀均有明显的抑制作用（P＜0.01），随着剂量的增加，对炎症的抑制作用越强，即抗炎强度呈现出剂量相关性。

3.5 对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

赤瓟子乙醇提取物对二甲苯所致的小鼠耳肿胀的影响结果见表4。由表4可知，与空白对照组相比，阳性对照组和CPZE高剂量组小鼠的耳肿胀度显著降低（P＜0.01），CPZE中剂量组、低剂量组小鼠耳廓肿胀度变化也表现出明显的差异性（P＜0.05），表明阳性对照药和高剂量的CPZE能够显著缓解小鼠耳朵因涂二甲苯而引起的局部刺激性炎症的症状，从而降低了小鼠的耳肿胀度。阳性对照组、CPZE高剂量组小鼠的耳肿胀抑制率位居前两位，分别为58.34%和54.76%，二者无明显差距（P＞0.05），这一结果不仅证明二者的抗炎活性较强，而且作用强度也相差无几，CPZE中剂量组和低剂量组的小鼠耳肿胀抑制率分别为27.85%和19.37%，低于CPZE高剂量组和阳性对照组，二者差异具有统计学意义（P＜0.05），提示CPZE低剂量和中剂量小鼠的耳肿胀度虽有所下降，但不如阿司匹林和CPZE高剂量组，即抗炎活性远低于阿司匹林和CPZE高剂量组。

4 讨论

热板法和扭体法是用于评价药物镇痛活性的经典实验方法，前者用于评价药物的中枢镇痛活性，后者用于评价药物的外周镇痛活性[8]。热板法系利用一定强度的温热刺激小鼠某一部位产生痛反应，热刺激强度使皮温度升高至45～55℃，低于45℃不会产生明显痛觉，高于55℃会灼伤小鼠，因此控制好热板温度是实验成败的关键。扭体法系将一定体积和浓度的化学刺激性物质注入小鼠腹腔内，刺激脏层和壁层腹膜，引起深部较大面积较长时间的疼痛，该反应在注射15min内出现频率高，该法缺点是缺乏一定特异性，因此必须辅助其他镇痛实验进行佐证[4]。本实验通过热板法和扭体法互相佐证、互为补充，使用两种实验方法不仅避免了单一实验方法出现的缺陷和误差，還能够准确无误地评价药物的镇痛活性。

小鼠耳肿胀法和大鼠足肿胀法作为筛选新抗炎药物的经典实验方法，具有操作简单、方法可靠、差异性小、重现性高的特点。小鼠耳肿胀法的操作难点在于涂二甲苯的部位与取下的耳片要相吻合，否则会产生较大偏差，大鼠足肿胀法的操作难点在于足肿胀厚度的测定，为避免出现较大误差，打耳片时提前在相应位置做好标记，测足肿胀厚度时采用数显游标卡尺，保证了实验数据的准确性和科学性。

蒙药赤瓟子作为常用民族药，在少数民族地区应用广泛，其化学成分复杂，药理活性多样。据文献报道，赤瓟子的化学成分主要有挥发油、皂苷、有机酸、香豆素、鞣质等[9，10]，赤瓟子不仅有镇痛抗炎活性，还具有抑菌、解热、免疫调节等药理活性[11]，因此赤瓟子具有较大的药用价值和广阔的开发前景。目前，赤瓟子的用法用量主要依据典籍的记载和医生的经验，由于缺乏有效的数据支撑，用药的安全性、有效性不能得到保证，这也限制了药物的开发和应用。本研究证明CPZE在体内具有显著的镇痛抗炎活性，但CPZE的毒性、体外活性及作用机制尚未探明，这对全面推进赤瓟子的现代化进程至关重要，后续的研究将为蒙药赤瓟子的临床合理应用和药物的开发利用提供更详细、更全面、更科学的参考依据。

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参考文献：

〔1〕卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准蒙药分册[M].北京：人民卫生出版社，1998.

〔2〕宋立人，洪恂，丁绪亮，等.现代中药大辞典（上册）[M].北京：人民卫生出版社，2001.

〔3〕赵波，张玉玲，佟继铭.赤雹果水提物抗炎作用及机制研究[J].时珍国医国药，2010，21（11）：2741-2743.

〔4〕徐叔云.药理实验方法学（第3版）[M].北京：人民卫生出版社，2002．

〔5〕李凤金，王博，霍金海，等.桄榔子醇提物对小鼠/大鼠的镇痛、抗炎作用[J].中国药房，2019，30（01）：59-63.

〔6〕曹海丽，曾聪彦，胡莹，等.舒脊片抗炎镇痛作用的实验研究[J].时珍国医国药，2019，30（11）：2579-2581.

〔7〕段小花，马晓霞，李兆福，等.不同剂量和煎煮时间对附子镇痛抗炎作用的影响[J].时珍国医国药，2018，29（10）：2385-2387.

〔8〕洪庚辛.镇痛药研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，2009.

〔9〕张玉玲，赵波，刘永平，等.赤雹根化学成分的系统预试验研究[J].承德医学院学报，2009，26（03）：246-248.

〔10〕于海龙，赵长祺，佟继铭，等.赤雹茎叶化学成分的系统预试验研究[J].承德医学院学报，2012， 29（02）：124-125.