生物信息学分析肾透明细胞癌中NLR信号通路的作用和临床意义

陈蔓莹，莫泳锋，覃洪宇，叶雨

生物信息学分析肾透明细胞癌中NLR信号通路的作用和临床意义

陈蔓莹1,2，莫泳锋1,2，覃洪宇1,2，叶雨1,2

1.广西医科大学第二临床医学院，广西南宁 530000；2.广西医科大学第二附属医院急诊科，广西南宁 530000

探讨寡聚化核苷酸结合结构域样受体（nucleotide-binding structural domain-like receptor，NLR）信号通路在肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）中的作用和临床意义，为寻找新靶点提供参考。从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、基因表达综合（gene expression omnibus，GEO）、ArrayExpress和GEPAI2.0等数据库中下载ccRCC相关数据，利用R软件分析NLR信号通路在正常组织和癌组织中的富集差异，及其与T、N、M、肿瘤分级和分期等临床指标间的相关性，进一步分析该通路与ccRCC患者预后的关系，单细胞测序数据用于聚类和基因表达分析，通过免疫逃逸相关的基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）和相关分析研究免疫与通路的关系，用免疫治疗数据进行生存分析和构建免疫相关生存预后模型。NLR信号通路在ccRCC中异常富集（<0.05），其富集趋势与各临床指标趋势相同，高富集该信号通路与不良预后有关（<0.05），上调NLR信号通路与下调NK细胞、M1巨噬细胞，上调中性粒细胞、巨噬细胞等免疫细胞浸润水平相关，同时分析表明该通路与免疫逃逸间存在相互作用，基于11个差异基因构建的免疫治疗生存预后模型预测患者1年、3年、5年生存率的受试者工作特征曲线曲线下面积分别为0.64、0.69、0.75。NLR信号通路是ccRCC的关键生物途径，与免疫逃逸之间的窜扰促使ccRCC发生、发展，11个NLR通路相关基因成功构建免疫疗法的生存预后模型，免疫疗法中它们可能是预后生物标志物和潜在治疗靶点。

肾透明细胞癌；寡聚化核苷酸结合结构域样受体信号通路；单细胞测序分析；免疫逃逸；生存预后模型

全球范围内，ccRCC的发病率与死亡率逐年升高[1-2]，酪氨酸激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂单药或联合治疗的中位无进展生存期最高为2年，中位总生存期不超5年[3]。因此仍需进一步探索ccRCC发生、发展的关键生物途径和关键机制，为寻找新的关键靶点提供理论参考。NLR信号通路在调控非特异性免疫反应中具有重要作用。它通过NLRC和NLRP两个NOD受体亚家族识别非特异性抗原，介导自噬和炎症等反应发生[4-5]。研究表明，NLR信号通路参与了多种肿瘤发生、增殖和侵袭。已有的研究中，激活该信号通路可诱导大部分癌症发生与进展，其中包括结直肠癌[6]、乳腺癌[7]、皮肤癌[8]、肝癌[9]、非小细胞肺癌[10]等，也可抑制胃癌、膀胱癌和部分肝癌增殖与转移[11-12]。而ccRCC中，有研究发现NLR信号通路是患者生存和肿瘤进展的危险因素[13]，高表达NLRP3可诱导癌细胞转移[14]，然而有关该生物途径在ccRCC中的临床意义、具体作用仍缺乏明确的研究。

本研究基于公共数据库的测序数据和临床信息，使用相关R软件包分析NLR信号通路在ccRCC组织中的富集情况，探讨其与患者预后和肿瘤分级、分期等临床指标，以及与肿瘤免疫浸润和免疫逃逸间的关系，探索该信号通路的作用和其发挥作用时参与的生物过程，明确其临床预后价值。为研究ccRCC发生、发展的机制提供部分理论支撑，为寻找新的肿瘤预后生物标志物和肿瘤治疗的新靶点提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 数据来源

从TCGA数据库下载534例ccRCC数据和72例癌旁数据，利用R软件（4.1.3版本）对转录数据进行Log2（TPM+1）转换。自ArrayExpress数据库（https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress）下载E-MTAB-1980队列数据。GSE178481单细胞测序数据从GEO数据库下载。在GEPAI2.0数据库（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）获得ccRCC差异性表达基因3183个（<0.05），其中高表达基因579个，低表达基因2604个。

1.2 ssGSEA和无监督聚类分析

TCGA和E-MTAB-1980队列数据中，利用ssGSEA R软件包对NLR基因集进行ssGSEA评分，用于评估该通路活性水平和富集程度。通过相关R软件包（NMF包）对TCGA-KIRC和E-MTAB-1980队列进行无监督聚类分析（NMF分析），将样本分组。

1.3 NLR信号通路与临床指标相关分析及生存分析

使用相关R软件包分析ccRCC的T、N、M分期、肿瘤分级和临床分期与NLR信号通路之间的关系。TCGA-KIRC和E-MTAB-1980队列聚类分组后进行生存分析，其中E-MTAB-1980队列作为外部验证。

1.4 单细胞测序数据分析

GEPAI2.0数据库的差异表达基因与NLR基因集交集后获得11个差异上调基因，使用Seurat R软件包对ccRCC的单细胞数据进行免疫与非免疫细胞分群，而后对免疫细胞进一步聚类和分析NLR基因集差异基因主要富集的免疫细胞。

1.5 NLR信号通路与免疫逃逸相关分析

使用GZMA与PRL1表达量的几何平均值代表溶细胞活性评分（cytolytic activity score，CYT），通过相关R软件包获得CYT和差异基因间的相关性列表，进行GSEA分析和相关性分析。

1.6 构建免疫治疗生存预后模型并评估预测效能

自Miao等[15]的研究中下载ccRCC免疫治疗数据，进行生存分析，利用11个差异基因构建免疫治疗生存预后模型，通过列线图可视化，使用受试者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线评估该模型的预测效能。

2 结果

2.1 NLR信号通路在ccRCC组织中显著富集并与ccRCC患者临床病理特征相关

利用ssGSEA R软件包对NLR基因集评分，分析癌组织和正常肾组织间的评分差异。结果如图1A所示，NLR受体信号通路在ccRCC中显著富集。临床病理特征相关性分析显示，两个数据集中，NLR信号通路评分与病理N分期均显著相关（<0.05）。而与T、M分期、肿瘤分级和临床分期在TCGA数据集中显著相关（<0.05，图1B），在E-MTAB-1980数据集中高富集该信号通路与更高的T、M分期、肿瘤分级和临床分期的趋势变化差异无统计学意义（0.05，图1C）。该结果表明NLR信号通路影响ccRCC的进展，增强该信号通路可能会诱导癌细胞迁移。

图1 通路富集差异与临床特征的相关性分析

A.NLR信号通路的富集差异；B.TCGA-KIRC样本中临床特征的相关性分析；C.E-MTAB-1980队列中临床特征的相关性分析

2.2 NLR信号通路与ccRCC患者不良预后

基于NLR基因集进行NMF分析（图2A、B），将TCGA-KIRC样本和E-MTAB-1980队列样本分别分为高、低组，进行Kaplan-Meier分析。结果如图2C、D所示，NLRhigh组的总生存期（OS）显著低于NLRlow组。

2.3 NLR信号通路与肿瘤免疫浸润

利用R软件评估22种免疫浸润细胞在ccRCC中的浸润水平，分析NLR信号通路与肿瘤免疫浸润间的关系，结果如图3A所示，高表达NLR信号通路与更高的幼稚B细胞、巨噬细胞M0、中性粒细胞、浆细胞、活化的记忆性CD4+T细胞、滤泡辅助性T细胞（Tfh）和Treg细胞等免疫细胞浸润水平显著相关（<0.05）；低表达NLR信号通路则与浸润程度更高的静息DC细胞、巨噬细胞M1、肥大细胞、NK细胞和静息的记忆性CD4+T细胞等免疫细胞显著相关（<0.05）。

图2 生存分析

A-B.TCGA-KIRC数据的NLR聚类分组；C.TCGA-KIRC样本的生存曲线；D.E-MTAB-1980队列的生存曲线

图3 免疫分析与单细胞测序分析

A.NLR信号通路与免疫细胞浸润水平的相关分析；B.差异基因和NLR基因集的交集；C.两聚类结果；D.两聚类中差异基因的表达分布；E、F.11个基因在各免疫细胞亚群中的表达

注：*<0.05，**<0.01，***<0.001

取2852个差异表达基因与该信号通路的62个基因的交集，获得11个差异性高表达基因（CXCL2、TRIP6、MAPK1、IKBKB、CCL2、MAPK10、IL18、MAPK13、CCL13、MAPK11、MAPK12，图3B）。利用Seurat包对单细胞测序数据进行质控、标准化后，将细胞分为免疫细胞、非免疫细胞两类（图3C），分析11个基因的分布情况，发现它们主要表达于免疫细胞（图3D）。继续对免疫细胞分群和可视化各免疫细胞群中差异基因的表达，结果如图3E、F所示，在癌组织中，11个差异基因主要表达于巨噬细胞、M1、M2型巨噬细胞、单核细胞、NK细胞、DC细胞和CD8+T细胞。

2.4 NLR信号通路与免疫逃逸

依据CYT其中位值将TCGA样本分为两组（CYTHigh和CYTLow）进行GSEA分析，发现NLR信号通路显著富集于CYTHigh组（图4A），相关性分析表明NLR信号通路与CYT呈显著正相关（=0.520，<0.001，图4B）。

由图5A可见，免疫治疗相关生存分析发现，高富集NLR信号通路的患者预后不良。利用11个差异表达基因构建免疫疗法的预后预测模型，使用列线图可视化该模型（图5B），ROC曲线分析评估该模型的预后预测效能，如图5C所示，免疫治疗中，ccRCC患者1年、3年、5年的总生存预后AUC分别为0.64、0.69、0.75，在ccRCC的免疫疗法中，该模型对患者的预后预测具有良好的敏感度和特异性。

图4 免疫逃逸相关性分析

A.GSEA富集；B.NLR信号通路与免疫逃逸相关性

图5 生存预后预测

A.免疫疗法中的总生存曲线；B.预后生存模型的列线图；C.ROC曲线分析

3 讨论

NLR信号通路通过介导自噬、炎症、血管生成、细胞焦亡等生物过程参与了多种肿瘤发生、发展[13, 17-18]。本研究通过对公开数据库中的测序数据和临床信息进行整合分析，探索NLR信号通路在ccRCC中的临床意义和具体作用，为进一步理解ccRCC的发生、发展机制和寻找新的有效靶点提供理论依据。

通过ssGSEA评分定量NLR信号通路的活性和富集水平，发现NLR信号通路在ccRCC组织中显著富集，并且其富集趋势与更高的T、N、M分期、肿瘤分级和肿瘤分期趋势一致，生存分析则表明激活该信号通路时，患者预后不良。

利用R软件分析NLR基因集与免疫浸润的相关性，使用单细胞测序数据进行细胞聚类和分析11个差异基因的表达分布，发现NLR信号通路与多种免疫细胞的浸润水平有关，其中与DC细胞、M1巨噬细胞、肥大细胞、NK细胞等免疫细胞的浸润程度呈负相关；与幼稚B细胞、M0巨噬细胞、中性粒细胞、Tfh和Treg细胞等呈正相关。ccRCC是免疫原性肿瘤，DC细胞通过抗原呈递作用呈递肿瘤新抗原可阻止ccRCC癌细胞免疫逃逸。更低级的ccRCC与更高的肥大细胞、巨噬细胞浸润有关,成熟的巨噬细胞分化为M1、M2巨噬细胞并多以M1、M2连续体存在，M1巨噬细胞和肥大细胞合成分泌促炎因子诱导炎症发生，M2巨噬细胞是促癌相关细胞，发挥炎症抑制作用，当连续体状态失衡可导致ccRCC发生与进展[19-20]。中性粒细胞由TGF-β信号介导与Tfh、Treg细胞共同参与肿瘤免疫抑制作用，促使肿瘤进展[21]。此外该信号通路的11个差异表达基因主要在NK细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、M1、M2型巨噬细胞群中富集，并且该信号通路与免疫逃逸呈正相关，激活该通路不利于免疫治疗后患者的生存。因此在ccRCC中增强NLR信号通路可能下调NK细胞、巨噬细胞M1，上调中性粒细胞、M0巨噬细胞等的浸润水平，调节肿瘤浸润性免疫细胞的浸润水平和构成，与免疫逃逸相互窜扰，参与肿瘤发生和发展。

NLR基因集的11个差异表达基因主要参与NF-κB和MAPK生物途径的信号传导。NF-κB和MAPK信号通路等调控癌组织的细胞因子水平是NLR信号通路影响癌症进展的主要机制[17]。基因集中，CCL2、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13是一组趋化因子，它们通过募集肿瘤相关成纤维细胞和肿瘤相关巨噬细胞，参与癌细胞与两类细胞间的相互作用，调节MAPK信号通路，诱导上皮-间充质转化，促使癌细胞转移和侵袭[22-23]。基因集的CXCL1、CXCL2、CXCL8作为NF-κB依赖性趋化因子，可通过上调肿瘤相关巨噬细胞和中性粒细胞抑制肿瘤免疫反应，诱导癌症转移[24-26]。

综上所述，本研究通过生物信息学技术，利用多个组织测序数据和单细胞测序数据分析证明了NLR信号通路是影响ccRCC发生、发展的关键生物途径，可能通过NF-κB和MAPK信号调节与免疫逃逸间的免疫窜扰，诱导ccRCC的发生与进展。免疫疗法的生存预后中，增强NLR信号通路与免疫治疗的不良预后有关，基于11个差异基因所构建的生存预后模型在预测免疫疗法的生存预后上具有良好的准确性。因此该基因集的11个差异基因可作为生物标志物和潜在靶点进行深入研究，同时后续可以通过探索介导该信号通路的基因寻找更有潜力的生物标志物和药物作用靶点。

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Role and clinical significance of NLR signaling pathway in renal clear cell carcinoma were analyzed by bioinformatics

CHEN Manying, MO Yongfeng, QIN Hongyu, YE Yu

1.The Second Clinical Medical College of Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi, China; 2.Department of Emergency, the second Affiliated Hospital of Guangxi Medical, Nanning 530000, Guangxi, China

To investigate the role and clinical significance of the oligomerized nucleotide-binding structural domain-like receptor (NLR) signaling pathway in clear cell renal cell carcinoma (ccRCC), and to provide a reference for the search of new targets.The TCGA-KIRC, GSE178481, E-MTAB-1980 and ccRCC different-expressed gene sets were downloaded from The Cancer Genome Atlas (TCGA), gene expression synthesis (GEO), ArrayExpress and GEPAI2.0 databases, respectively. The enrichment difference of NLR signaling pathway in normal tissues and ccRCC, and the correlation between T, N, M, tumor grade and stage were analyzed using the R package. And then prognosis of patients with ccRCC was analyzed. Cluster and gene expression analysis were performed on single-cell sequencing data, and The relationship between NLR signaling pathways and immune escape was analyzed by gene set enrichment analysis (GSEA) and correlation analysis. Immunotherapy-related data were used for survival analysis and construction of immune-related survival prognostic models.NLR signaling pathway was abnormally enriched in ccRCC (<0.05), and its enrichment trend was the same as that of all clinical indicators. High enrichment of this signaling pathway was associated with poor prognosis (<0.05). The activated NLR signaling pathway was associated with down-regulation of NK cells and M1 macrophages, and up-regulation of neutrophils and macrophages etc. GSEA analysis and correlation analysis of immune escape indicated the interaction between this pathway and immune escape. The AUC of immunotherapy survival model constructed with 11 differential genes of NLR signaling pathway was 0.64, 0.69 and 0.75 in predicting 1-year, 3-year and 5-year survival, respectively.NLR signaling pathway is a key biological pathway of ccRCC, and this pathway interacts with immune escape and promotes the development of ccRCC and eleven NLR pathway related genes successfully constructed immunotherapy survival prognostic models, which may be prognostic biomarkers and potential therapeutic targets in immunotherapy.

Clear cell renal cell carcinoma; NLR signaling pathway; Single cell sequencing analysis; Immune escape; Survival prognosis model

R737.11

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.26.018

叶雨，电子信箱：yeyu9698@163.com

（2022–12–07）

（2023–08–24）