NF2基因多态性与脑膜瘤预后的相关性

黄冠又，郝淑煜，冯洁，王亮，张力伟，张俊廷，吴震*

1贵阳市第二人民医院神经外科，贵州 贵阳 550081；2首都医科大学附属北京天坛医院神经外科，北京 100070；3首都医科大学北京市神经外科研究所，北京 100070

脑膜瘤（meningioma）起源于蛛网膜帽状细胞，约占中枢神经系统肿瘤的38.3%，是常见的成人颅内良性肿瘤，女性多见[1-2]。脑膜瘤的病因尚不明确，研究显示可能与生活方式、环境因素及基因、遗传易感性等多种因素有关[3-6]。脑膜瘤多数为良性，行手术切除后通常预后较好，但仍有约6.9%的患者出现肿瘤复发[7]。研究显示，脑膜瘤复发除与病理分级和肿瘤切除程度有关外，也可能与遗传学因素有关[8]。神经纤维瘤病Ⅱ型（neurofibromatosis 2，NF2）是与脑膜瘤发生相关的遗传综合征，22 号染色体细胞遗传学改变和NF2基因突变在脑膜瘤形成初期发挥了关键作用[9]。研究显示，40%～60%的散发脑膜瘤患者存在NF2基因突变或22 号染色体缺失[10]，不同病理亚型脑膜瘤的NF2突变率不同，纤维型和过渡型脑膜瘤的NF2基因突变率为70%～80%，而内皮型脑膜瘤的NF2基因突变率仅为25%，提示不同病理亚型的脑膜瘤在形成过程中伴随着不同的遗传学改变[11]。大多数单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）在功能上是中性的，但编码区的SNP 可影响蛋白质氨基酸序列，从而影响基因表达，可能增加脑膜瘤的发病和复发风险[12]。目前NF2基因SNPs 与脑膜瘤易感性及预后的关系少见报道。本研究针对脑膜瘤患者的NF2基因位点多态性进行研究，探讨NF2基因多态性与脑膜瘤预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2010 年5 月－2011 年1 月于首都医科大学附属北京天坛医院神经外科中心接受手术治疗并经病理学检查确诊为脑膜瘤的患者215例，男57例，女158例，年龄16～75（50.2±10.3）岁。纳入标准：（1）有详细完整的临床病史资料、影像学资料及围手术期资料；（2）行显微手术切除肿瘤，肿瘤切除程度有明确的手术记录；（3）根据2021 年第五版世界卫生组织（World Health Organization，WHO）中枢神经系统肿瘤分类标准[13]，术后病理诊断为脑膜瘤；（4）未接受过放射治疗和（或）化疗；（5）随访时间＞8年。排除标准：有严重基础疾病、精神障碍或合并其他多器官功能障碍，合并其他颅内肿瘤或其他器官存在肿瘤。

另选择同一时期在北京天坛医院行健康体检者218 例为对照组，男74 例，女144 例，年龄24～79（48.5±9.7）岁。两组性别、年龄差异均无统计学意义，具有可比性。本研究获首都医科大学附属北京天坛医院伦理委员会批准（KY2018-047-01）。研究对象均签署知情同意书。

1.2 实验试剂与仪器 血液基因组DNA 抽提试剂盒、HotStar Taq DNA 聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、溴化乙锭、溴酚蓝及PCR 引物等购自上海生工技术有限公司； SNaPshot Multiplex Kit、 Genescan-120LIZ Size Standard、去离子甲酰胺Hidi-Formamide 上样液购自美国ABI 公司；虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）购自美国Promega公司；核酸外切酶Exonuclease Ⅰ（ExoⅠ）购自美国Epicentre 公司；DNA Marker购自美国Invitrogen公司。电泳仪购自美国Bio-Rad 公司；PCR 仪、ABI 3730XL 测序仪购自美国ABI公司。

1.3 外周血基因组DNA提取 抽取受试者清晨空腹外周静脉血5 ml，加入0.4 ml 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）防止血液凝固，置于－20 ℃低温冰箱保存备用。利用血液基因组DNA抽提试剂盒，按照操作说明书提取基因组DNA。对提取到的DNA样本应用紫外分光光度计检测其浓度和纯度，根据OD260/OD280的比值判断DNA纯度，比值范围在1.8～2.0 为纯度合格；若不在此范围，则重新取血并提取DNA。将提取好的DNA 样本放置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 引物设计与合成 根据NCBI 中的dbSNP 数据库，查找并下载NF2基因数据信息；从Ensembl数据库（https：//asia.ensembl.org/）中选择中国汉族人群作为样本，将得到的文件导入HaploView 4.2 软件中，以参数r2＞0.8、最小等位基因频率＞0.05为筛选条件，运行HapMap数据，选中筛选的SNPs，运行tag得到tagSNP，包括rs2530673 和rs2530662。应用在线引物设计软件Primer3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）在需要检测的位点两侧设计引物。引物序列：多态位点rs2530673，上游5'-TGGCAGAGAATAGCAGGAA CA-3'， 下游5'-TCCAGCCTCAGTGACAGAACA-3'，PCR 扩增片段长度388 bp；多态位点rs2530662，上游5'-GCGCTGTAGCTGTATAGTA-3'，下游5'-AGGCA CTCTCTATTCCTTA-3'，PCR 扩增片段长度385 bp。两对引物均由上海生工技术有限公司合成。PCR 产物用HotStarTaq DNA 聚合酶进行多重PCR 获得，经SAP和ExoⅠ纯化后用SNaPshot Multiplex kit 进行延伸反应。20 μl PCR 反应体系包括：2 μl 10×PCR Buffer，0.8 μl MgCl2（50 mmol/L），0.5 μl dNTP（10 mmol/L），1 μl DNA 样本，0.5 μl HotStar Taq DNA 聚合酶（2.5 U），14.2 μl ddH2O 和1 μl PCR 引物。PCR 扩增条件：95 ℃预变性2 min 后进行11 个周期的温度递减循环（94 ℃变性20 s，65 ℃～60 ℃退火40 s，每个周期递减0.5 ℃，72 ℃延伸1.5 min），随后进行24个周期的恒温循环（94 ℃变性20 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min），72 ℃延伸2 min，4 ℃保持。

1.5NF2基因多态性检测 应用多重单碱基延伸SNP分型技术（Multiplex SNaPshot）进行目的基因的多态性检测。检测多态位点为NF2基因rs2530673 和rs2530662。（1）多重单碱基延伸引物：rs2530673，tttttttttttttttttttttttttttttttttCAATGACTTACCTTCCAGA CCT；rs2530662，ttttttttttttttttttttttttttttGTAGAGATGC TACCAGTTTCCT。（2）延伸反应程序：96 ℃预变性1 min；96℃变性10 s，55℃退火5 s，60℃延伸30 s，共28 个循环。（3）基因测序：取纯化好的0.5 μl PCR延伸产物，与0.5 μl Genescan-120LIZ Size Standard、9 μl Hi-Di 溶液混匀，95 ℃变性5 min 后，在PRISM 3730XL 测序仪上测序，运行GeneMapper 5.0软件查看.fsa文件，按照软件操作说明的步骤分析样品及查看最终结果，得到分型胶电泳峰型图及单位点分型图，不同峰的颜色代表不同碱基种类，从而确定样本的基因型。

1.6 随访 术后采用电话、门诊、微信等方式对脑膜瘤患者进行随访，截至2018 年9 月25 日，平均随访时间为（8.16±0.18）年。无进展生存期（progressionfree survival，PFS）为患者确诊脑膜瘤日期至发现肿瘤复发或患者死亡的时间，失访及仍健在的患者按截尾数据处理，均以年为单位计算。

1.7NF2基因多态性对脑膜瘤发病风险及预后的影响分析 各位点基因型与脑膜瘤发病风险的相关性采用非条件logistic 回归分析，分别在显性遗传模型及隐性遗传模型下计算相关优势比（odds radio，OR）和95%可信区间（confidence interval，CI）。设R 为野生型等位基因，W 为突变型等位基因，显性遗传模型以RR基因型为参照，进行WW+WR与RR的比较；隐性遗传模型以RR+WR 联合基因型为参照，进行WW 与WR+RR 的比较。应用χ2检验评估位点rs2530673和rs2530662中基因型和等位基因频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，当P＞0.05时认为基因频率符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群体代表性。应用Kaplan-Meier 方法进行预后分析，Log-rank检验比较NF2基因多态位点rs2530673和rs2530662不同基因型脑膜瘤患者生存曲线的差异；采用Cox 风险比例模型评估各影响因素与脑膜瘤患者复发的关系，各自变量对结局变量的影响以风险比（hazard ratio，HR）及其95%CI表示。

1.8 统计学处理 采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。计量资料符合正态分布时以xˉ±s表示，组间比较采用t检验；计数资料组间比较采用χ2检验。相关性分析采用非条件logistic 回归分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床病理资料 215例脑膜瘤中，WHO 1级196例（91.16%），WHO 2 或3 级19 例（8.84%）。病理亚型分布方面，脑膜上皮型75例（34.88%），纤维型59例（27.44%），过渡型50 例（23.26%），血管瘤型6 例（2.79%），砂粒型1 例（0.47%），微囊型4 例（1.86%），分泌型1例（0.47%），非典型性17例（7.91%），间变性2例（0.93%）。肿瘤部位分布，（1）非颅底脑膜瘤：大脑凸面34 例（15.81%），矢状窦/镰旁44 例（20.46%），侧脑室5 例（2.32%），第三脑室1 例（0.46%），幕上多发6 例（2.79%）；（2）颅底脑膜瘤：嗅沟、前颅底28例（13.02%），蝶骨嵴21例（9.77%），鞍旁-中颅底6例（2.79%），岩斜区34 例（15.81%），桥小脑角16 例（7.44%），枕大孔区6 例（2.79%），小脑幕14 例（6.51%，表1）。

表1 脑膜瘤215例的临床病理资料Tab.1 The clinical and pathological data of 215 meningioma cases

2.2NF2基因多态位点的基因型分布NF2基因两位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡（rs2530673：χ2=3.029，P=0.085； rs2530662：χ2=0.742，P=0.401），具有群体代表性。NF2基因rs2530673 位点存在CC、CT 和TT 3 种基因型，rs2530662 位点存在AA、AT 和TT 3 种基因型。2 组NF2多态位点rs2530673和rs2530662基因型及等位基因频率分布差异均无统计学意义（P＞0.05，表2）。

2.3 按病理类型分层分析NF2基因多态性与脑膜瘤的发病风险 将脑膜瘤常见的3种病理亚型（脑膜上皮型、纤维型、过渡型）在不同遗传模式（显性模型和隐性模型）下进行分层分析。显性遗传模型（rs2530673：CC/CTvs.TT；rs2530662：TT/ATvs.AA）和隐性遗传模型（rs2530673：CCvs.CT+TT；rs2530662：TTvs.AT/AA）分布下，脑膜上皮型和纤维型脑膜瘤患者NF2基因rs2530673和rs2530662多态位点基因型频率分布与对照组比较差异均无统计学意义，NF2基因多态位点rs2530673和rs2530662与脑膜瘤的发病风险相关性均不显著（P＞0.05）。NF2基因多态位点rs2530673 在显性遗传模型（CC/CTvs.TT）分布下，CC基因型发生过渡型脑膜瘤的风险明显降低（P＜0.05，表3）。过渡型脑膜瘤患者NF2基因位点rs2530662 基因型频率分布与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05，表4）。

表3 按病理类型分层的NF2基因多态位点rs2530673与脑膜瘤易感性的相关性分析结果Tab.3 Stratification analysis of relationship between NF2 gene polymophism rs2530673 and meningioma susceptibility with different pathologic subtypes

表4 按病理类型分层的NF2基因多态位点rs25306662与脑膜瘤易感性的相关性分析结果Tab.4 Stratification analysis of relationship between NF2 gene polymophism rs2530662 and meningioma susceptibility with different pathologic subtypes

2.4NF2基因多态位点不同基因型与脑膜瘤预后的相关性 215例脑膜瘤中，196例（91.2%）获随访，19例失访（8.8%）。随访期间，166例（84.7%）恢复良好，大多生活可自理；肿瘤复发24例（12.2%）；死亡6例（3.1%）。Kaplan-Meier 单因素生存分析结果显示，NF2基因多态位点rs2530673 CC、CT+TT 基因型患者的PFS 分别为（7.772±0.352）年、（8.091±0.089）年，CC、CT+TT 基因型与脑膜瘤患者预后相关不显著（Log-rankχ2=0.272，P=0.602）；rs2530662 AA、AT+TT 基因型患者的PFS 分别为（8.022±0.124）年、（8.129±0.119）年，AA、AT+TT 基因型与脑膜瘤患者预后相关不显著（Log-rankχ2=0.004，P=0.949，图1）。

图1 脑膜瘤患者NF2基因多态位点不同基因型与PFS的相关性Fig.1 Correlation between different genotypes of NF2 SNPs and PFS

在颅底脑膜瘤中，NF2基因多态位点rs2530673 CC、CT+TT 基因型患者的PFS 分别为（8.147±0.195）年、（8.170±0.190）年，CC、CT+TT基因型与肿瘤复发相关不显著（Log-rankχ2=1.338，P=0.247）；rs2530662 AA、AT+TT 基因型患者的PFS 分别为（8.151±0.190）年、（8.192±0.189）年，AA、AT+TT 基因型与肿瘤复发相关不显著（Log-rankχ2=1.506，P=0.220，图2）。在非颅底脑膜瘤中，NF2基因多态位点rs2530673 CC、CT+TT 基因型患者的PFS 分别为（6.768±0.806）年、（8.007±0.150）年，CC 基因型PFS较CT+TT 基因型缩短，复发风险增高（Log-rankχ2=4.574，P=0.032）；rs2530662 AA、AT+TT基因型患者的PFS 分别为（7.743±0.227）年、（8.175±0.174）年，AA、AT+TT基因型与肿瘤复发相关不显著（Log-rankχ2=1.254，P=0.263，图3）。

图2 NF2基因多态位点不同基因型与颅底脑膜瘤PFS的相关性Fig.2 Correlation between different genotypes of NF2 SNPs and PFS in skull base meningioma

图3 NF2基因多态位点不同基因型与非颅底脑膜瘤PFS的相关性Fig.3 Correlation between different genotypes of NF2 SNPs and PFS in non skull base meningioma

2.5 脑膜瘤PFS 影响因素的Cox 多因素分析结果

将性别、年龄、术前KPS 评分（≥70、＜70）、肿瘤部位（颅底、非颅底）、WHO 分级（1 级、2－3 级）、肿瘤切除程度（全切、大部切除）及NF2基因多态位点rs2530673、rs2530662 纳入Cox 比例风险模型进行多因素分析，结果显示，WHO分级是影响脑膜瘤患者PFS（HR=27.117，95%CI 10.040～73.241，P=0.000）的独立影响因素，而NF2基因多态位点则不是脑膜瘤预后的影响因素（P＞0.05，表5）。

表5 脑膜瘤196例无进展生存影响因素的Cox多因素回归分析Tab.5 Cox multivariate regression analysis on PFS of 196 meningiomas

3 讨 论

NF2基因位于染色体22q12，长约110 kb，包含17个外显子，并编码含595个氨基酸残基的Merlin蛋白，该蛋白结构包含3 个功能域：1 个氨基末端域、1个α螺旋域和1个羧基端[14]。研究显示，当NF2基因突变时，Merlin 蛋白表达下降或失活，可促进脑膜瘤细胞的增殖，可能引起颅内多发良性肿瘤（如神经鞘瘤）及其他非神经系统肿瘤（如肾细胞癌、甲状腺癌、间皮瘤和黑色素瘤）的发生发展[15]。50%以上的散发脑膜瘤和大部分神经纤维瘤病相关的脑膜瘤存在NF2基因突变，该基因突变的形式大部分为无义突变、框架移位突变或拼接点突变，这些突变能产生一种截短或无功能的蛋白质，其基因失活与脑膜瘤早期形成有关，且能引起脑膜瘤分子特征和临床表型方面的改变[9-10]。

NF2基因发生单个核苷酸的基因序列变异（即SNP）是否会改变脑膜瘤的易感性，或增加脑膜瘤的发病风险以及是否与肿瘤的预后有关目前尚不明确。内含子可影响基因的表达和调控，如影响剪接和编码前体mRNA 进而影响RNA 表达水平，具有增强基因表达的作用，内含子SNP 也可作为增强子或启动子调节基因的表达[16]。NF2基因内含子多态位点处发生碱基转换引起的基因变异在脑膜瘤发病过程中的作用尚不清楚；rs2530673 和rs2530662 位点位于NF2基因的内含子区域，可能通过影响pre-mRNA的剪接或影响基因启动子转录活性参与基因表达调控[17]。查阅相关文献，未见这两个多态位点的相关报道，因此本研究选取NF2多态位点rs2530673 和rs2530662作为研究脑膜瘤易感性的候选基因。

本研究结果显示，脑膜瘤组NF2基因多态位点rs2530673和rs2530662的基因型和等位基因分布频率与对照组差异不显著，在不同病理级别的脑膜瘤中，也未发现上述基因多态位点与脑膜瘤易感性显著相关。按照WHO 1级病理亚型分层，在显性模型分布下，携带NF2基因rs2530673 位点CC 基因型的人群发生过渡型脑膜瘤的风险降低50.6%，提示NF2基因rs2530673 多态性与过渡型脑膜瘤的发生相关，C 等位基因可能是过渡型脑膜瘤发病的保护性因素，突变型等位基因T则是过渡型脑膜瘤发病的风险因素。T 等位基因是否能上调NF2基因表达、发挥抗细胞凋亡的作用尚不清楚。另外，虽然rs2530673 和rs2530662 位于内含子区，可能与该基因上位于外显子区域的多态性位点呈现连锁不平衡[18]，但是否与其他未检测到的功能位点存在协同作用仍需进一步探讨。本研究未进行全基因组关联分析，也没有进行NF2基因表达的功能实验，因此在位点选择上有所局限，不能排除与其他基因位点存在连锁作用，影响NF2的表达及功能，从而导致脑膜瘤发生的可能。

本研究结果显示，多态位点rs2530662与不同病理亚型脑膜瘤易感性均相关不显著，提示该位点在脑膜瘤的发病过程中未发挥明显作用；而位于内含子的多态位点rs2530673变异可能在过渡型脑膜瘤发病过程中起一定作用，纤维型和过渡型脑膜瘤中NF2基因突变率较高[11，19]，推测该亚型脑膜瘤的发病可能与位点rs2530673 中T 等位基因促进NF2基因变异有关，但具体作用机制尚不清楚，有待进一步研究验证。

NF2基因的遗传改变可能影响脑膜瘤的进展，为探讨NF2基因变异对脑膜瘤术后复发的影响，本研究分别对不同多态位点基因型的脑膜瘤进行生存分析，结果显示NF2基因位点rs2530673和rs2530662与脑膜瘤的预后相关不显著；但根据肿瘤部位进行分层分析发现，在非颅底脑膜瘤组中，NF2基因rs2530673 位点与脑膜瘤术后复发相关。有研究显示，非颅底脑膜瘤较颅底脑膜瘤在生物学行为方面更具侵袭性，肿瘤更易复发[20]。NF2基因突变的脑膜瘤多好发于大脑凸面，提示多态位点rs2530673是非颅底脑膜瘤复发进展的一个潜在危险因素，其遗传学改变可能与NF2基因其他多态位点共同作用，增加非颅底脑膜瘤的患病风险，这可能是由于NF2rs2530673 基因突变后其表达水平改变，影响了细胞周期调控和细胞信号转导，进而导致肿瘤的发生。而在颅底脑膜瘤组中，位于内含子的两个多态位点与肿瘤PFS 相关不显著，提示这些位点在颅底脑膜瘤的发病和复发进展过程中未发挥明显作用，可能存在其他非NF2基因的遗传变异对颅底脑膜瘤的发生发展起作用[21]。

关于NF2基因变异与脑膜瘤发生、发展及预后的相关研究报道较少，本研究也未发现NF2基因多态位点rs2530673和rs2530662与中国人群脑膜瘤遗传易感性显著相关。考虑到纳入研究的样本量、肿瘤部位、病理级别分型，以及肿瘤影像特征差异这些因素相互影响，可能导致研究结果不同，造成结论不一致，且本研究随访时间不长，只分析了NF2基因两个位点的多态性，可能造成研究偏倚。因此，为全面深入了解NF2基因与脑膜瘤发病的关系，还需进一步扩大样本量，对多个SNP 位点进行联合分析，并对患者密切随访，从遗传学角度深入研究脑膜瘤术后复发的影响因素及相关机制。