发酵黄油风味代谢及风味相关研究进展

刘景，徐振波

（丰益（上海）生物技术研发中心有限公司，上海 200137）

0 引 言

发酵黄油 (fermented butter/sour butter/cultured butter)也称为酸黄油，是经过乳酸菌等菌种发酵而制成的黄油，因其丰富的风味和令人愉悦的口感深受消费者喜爱，近年在中国随着烘焙产业的快速发展也越来越被人们所熟悉。发酵黄油中一系列风味相关化合物对人体嗅觉、味觉和化学感觉（或三叉神经）刺激的综合感知，就是我们所感知到的发酵黄油风味。在关于发酵黄油的质量评价中，风味是其中一个重要因素。

与普通黄油相比，发酵黄油具有更浓郁的风味、以及更丰富的风味层次。这些风味一部分来源于高含量乳脂所带来的挥发性成分，另一方面，发酵工艺也产生了诸如酸类、醛类、酮类、酯类等多种重要的风味化合物，这些化合物的共同作用令黄油自带一种发酵香气，并且风味相比未发酵黄油更为浓郁饱满。

目前在黄油中已鉴定出几百种挥发性化合物，但其中只有少数几种被报道证实与黄油的特征香气有联系。如具有水果和奶油特征风味的内酯，以及具有玉米和大蒜气味的含硫化合物[1-2]。与未发酵黄油不同的是，发酵黄油则通常以其强烈的双乙酰味道为特征[3]。除了对特征或关键风味及风味物质的报道，目前针对发酵黄油整体风味化合物及其相关代谢、以及风味化合物对风味作用等的系统性研究较为缺乏。本文将综述以上问题，对近年来发酵黄油及风味相关研究进展作逐一介绍。

1 发酵黄油中的主要代谢过程

发酵黄油是经过发酵工艺步骤制得的黄油，属于黄油中一种特殊的品类。由于发酵培养通常会产生酸性物质，发酵黄油也叫酸黄油（或培养黄油）；相对地，未发酵黄油通常也称为甜黄油。发酵黄油的主要制作流程见图1，包括脂肪分离、杀菌、接种、发酵、相转换、压炼等过程。其中核心工艺是发酵步骤。接种后的细菌发酵剂在合适的工艺条件下通过一系列反应将底物转化为多种风味化合物，例如将乳糖转化为乳酸、脂肪转化为中短链脂肪酸等。

发酵黄油中的代谢根据不同的底物类型主要可分为碳水化合物、脂类和蛋白质的代谢。这些底物经过包括乳酸菌在内的一种或几种微生物代谢初步降解为丙酮酸、脂肪酸、氨基酸等中间产物，再经过一系列酶参与下的反应途径，最后形成酸、酮、醛、内酯等多种风味化合物，如图2 所示。

图2 发酵黄油底物及其风味化合物降解途径

1.1 碳水化合物代谢

通常情况下，发酵黄油的底物稀奶油中含有2.0%～3.0%的碳水化合物，其中大部分是乳糖。在通常的发酵条件下，乳糖被乳酸菌等发酵菌种迅速分解为半乳糖等单糖后，再进入下一步降解。对比发酵黄油中可能使用的几种菌种代谢乳糖过程中的运输、代谢和调节表现，表1 总结了常见发酵菌种一些乳糖代谢途径的特性。乳酸菌可以在NADH 氧化酶和丙酮酸氧化酶介导的反应中利用氧气，通过丙酮酸脱氢酶-磷酸转乙酰酶-乙酸激酶[4]或丙酮酸酶-乙酸酶途径[5]，形成包括H2O2在内的中间产物和额外的ATP。目前，乳酸菌中糖酵解的控制和调节机制尚不完全清楚，乳酸菌对糖酵解速率的控制并不只是基于单一酶类、糖转运或完全依赖ATP，更有可能是包括以上几种机制的共同作用。

表1 发酵黄油中常见菌种乳糖代谢的特点

发酵黄油中另一类重要的糖类代谢是柠檬酸途径，这条途径与风味密切相关。其过程可简要描述为：柠檬酸盐在柠檬酸裂解酶的作用下产生乙酸盐和草酸盐，草酸盐脱羧酶将后者脱羧为丙酮酸盐和CO2；生成的丙酮酸盐与另一个丙酮酸分子缩合形成α-乙酰乳酸和CO2；中间产物α-乙酰乳酸可以通过化学方式自发降解为双乙酰，或通过酶降解为乙偶姻（3-羟基-2-丁酮）。其中双乙酰、乙醛等直接影响风味的形成，而乙偶姻作为双乙酰的前体则对风味产生间接影响。一些商业菌种具有良好的柠檬酸盐代谢能力，如明串珠菌属和乳酸乳球菌某些亚种等，通过代谢柠檬酸盐形成双乙酰而提供奶油风味（buttery）。它们作为风味的主要贡献菌，通常与中温产酸菌株（如乳球菌）结合使用[6]。这些具备产双乙酰能力的菌种在奶酪、发酵黄油和酸奶等发酵乳制品中具有非常重要的作用[7]，有助于发酵乳制品产生浓郁饱满的风味。由于柠檬酸途径在工业，特别是风味上的重要性[8]，人们非常重视代谢工程策略，以增强柠檬酸盐代谢，并将其导向特定终产物（尤其是双乙酰）含量的增加[9-10]。

1.2 脂类代谢

基于含量的优势，脂类是黄油在发酵过程中最主要的底物。黄油中的脂质首先会发生氧化或水解。甘油三酯酶解（脂解）为游离脂肪酸（Free Fatty Acids, FFA）和甘油、单甘油三酸酯或双甘油三醇，其中FFA 被认为是风味演化的关键。因具有疏水性，脂质既是风味化合物的优良载体，也是许多风味化合物的前体。脂肪分解和脂肪酸分解代谢是发酵过程的关键之一，产生的风味化合物在许多发酵乳制品中都很重要[11]。另外，由于人类口腔对脂类代谢物的敏感性，脂肪在发酵乳制品风味质量上也有一定的指示作用[12]。比如，在脂肪分解水平较低的黄油或无水黄油中，FFA 也会被感知；并具体根据FFA 的浓度和风味特征，判断可预期的风味平衡或风味缺陷[13]。

尽管脂解非常重要，但其机制中所涉及的酶及酶活性的主要影响因素仍未明确。基因组测序为乳制品相关微生物中存在的潜在酯酶提供了分子层面的全新见解，但对乳脂的特异性活性仍然需要使用生化方法进行研究[14]。另一方面，现有乳制品中关于脂肪酸分解代谢途径的研究集中于干酪发酵剂的活性，人们因此更好理解和控制各类发酵乳制品中游离脂肪酸衍生风味化合物的形成[15-16]。这些研究结果可作为发酵黄油风味相关脂类及脂肪酸代谢的重要参考。

1.3 蛋白质代谢

蛋白质水解是乳制品中研究最广泛的生化变化。黄油中通常含有2%左右的蛋白质，尽管含量不高，但发酵过程中的蛋白质水解是发酵黄油产品风味形成的基础。在发酵黄油的生产过程中，在各种蛋白水解酶的共同作用下，酪蛋白逐渐分解。不同途径的蛋白质降解为不同的氨基酸，并进一步分解释放具有各异风味特性的短肽。这些酶包括乳内源酶（如纤溶酶、组织蛋白酶）、发酵剂产生的细胞膜相关蛋白酶以及肽酶等。

蛋白质水解产物本身（即肽和游离氨基酸）对发酵黄油风味的影响更多体现在“背景”风味方面，某些情况下可能与一些异味（如苦味）相关[17]。比如，游离氨基酸作为一系列分解代谢反应产生的挥发性风味化合物的前体，虽然没有直接产生香气，但因为酪蛋白产生氨基酸释放速率的增加可激发发酵微生物，为其提供多种代谢物前体，因此在香气形成中起着至关重要的作用。另一方面蛋白质水解也可能为几种替代途径中酶的合成提供必要氨基酸[18]。因此，蛋白质的代谢有助于构建发酵黄油的良好香气和风味的框架背景。

2 发酵黄油的风味化合物

2.1 脂肪酸

发酵黄油含有高达80%以上的脂肪，乳脂肪在脂肪酶作用下发生降解。其中，甘油三酯（占乳脂的98%以上）的水解是乳脂最主要的生化转化，该反应会产生游离脂肪酸（FFA）、二甘酯、单甘酯，以及可能的甘油等。其中，游离脂肪酸类对发酵黄油风味有重要贡献。

低分子脂肪酸，如乙酸和丁酸，除本身具有酸味外，也是风味活性化合物。与乙酸类似，丁酸也是乳糖发酵的产物。而一些中短链脂肪酸，尤其是C4∶0 和C12∶0 之间的FFA，具有特征性风味，如酸味、尖锐味、山羊味、肥皂味，椰子味等。FFA 的风味强度不仅取决于含量浓度，还取决于其在水相和脂肪相之间的分布、介质的pH 值、某些阳离子（例如Na+、Ca2+）的存在以及蛋白质降解产物等多种因素[19]。

另一方面，脂肪酸也是多种风味物的前体物质，涉及了多种风味相关化合物的反应途径如图3 所示。比如，中链脂肪酸（主要从C6∶0 到C12∶0）氧化为β-酮酸，经过脱羧反应生成相应少一个碳原子的甲基酮，再进一步生成二级醇；某些不饱和脂肪酸会氧化生成氢过氧化物，在酶的作用下生成醛类，进而氧化成酸或者醇。可以说，脂肪酸的代谢会影响大部分其他风味化合物（如酮、醛、酸、醇、内酯等）的生成。因此，脂肪酸类是研究发酵黄油风味最重要的物质之一。

图3 发酵黄油中的脂类代谢

2.2 羰基化合物

发酵黄油中常见与风味相关的的羰基化合物主要是酮、醛等化合物。酮是一种羰基分子（=C=O），是发酵黄油最重要的风味化合物之一。发酵黄油中酮的来源主要有3 种：不饱和脂肪酸降解、氨基酸降解或发酵微生物代谢。微生物代谢是其中最主要的途径。脂肪被菌种代谢降解为脂肪酸后氧化生成β-酮酸、进一步通过脱羧反应形成酮类化合物。酮类化合物大多数都具有特殊香气，且阈值较低（浓度一般为μg/L）。比如，双乙酰（2,3-丁二酮）是发酵乳制品风味形成的关键芳香化合物，其风味特征是特殊的奶油香气；2-壬酮则能赋予发酵乳制品奶油味和水果香味[20]。另外有报道指出，含有黄油的烘焙食品的主体风味成分是甲基酮[21]。甲基酮的前体以酮酸形式存在于新鲜黄油中，受热后即转化为甲基酮，甲基酮是含有黄油的熟食和加热食品中的主要的挥发性风味化合物。

2.3 内酯

内酯是由γ-和δ-羟基酸与相应的醇结合而成的内部形成的环状酯，通常具有广泛的风味特征，包括黄油味、椰子味、奶油味、水果味、坚果味、甜味等。游离态内酯是黄油的主要挥发性成分，而使用这些黄油产品制成的糕点或烘焙食品也因此具有这些特征性风味。乳制品中的内酯大部分是偶数碳原子数，如δ-己内酯[22]等。在未发酵黄油（甜黄油）中报道的一些内酯包括δ-辛内酯、δ-己内酯和γ-十二内酯等[23]。其中δ-己内酯和γ-十二内酯分别有奶油和类似桃子的气味；而δ-十内酯具有一种非常强烈的气味和奶油味，浓度小于5×10-6g/L。它也是香料行业的关键内酯，广泛应用于乳品和水果香精。

另外，内酯前体也会间接影响风味，特别是当黄油作为烘焙或烹饪原料时。发酵黄油中含有的无味内酯前体羟基酸，在温度升高的影响下会发生自动重排，转化成为风味明显的γ-内酯和δ-内酯，并缓慢释放[21，24]。而乳脂特定的熔融特性又会影响这种释放速率，从而影响整体风味轮廓。这种特殊的风味转化与释放特征也是迄今为止无法通过在人造黄油中加入合成香味物质来达到天然黄油感官质量的重要原因之一。

2.4 含硫化合物

发酵黄油的挥发性成分中通常含有多种含硫化合物，如甲硫醇、硫化氢、二甲基硫醚、二甲基二硫化物、二甲基三硫化物、二甲四硫化物等。目前这些已知含硫化合物来源于蛋氨酸Met，通过一系列氧化还原及酶作用，生成甲基硫后，再经过氧化产生各种硫化物。这些硫化物大多具有洋葱风味特征，均有助于形成复杂的香气[25]。此外，Shooter 等[26]经过对黄油中挥发性硫化合物的选择性研究，发现由于不同季节牧草成分的变化，春季黄油中的甲硫醇和二甲基二硫化物浓度增加，而在储存期这些化合物又会显著减少；含硫化合物的变化可能是不同的牧场环境或牧草影响黄油风味的主要原因之一。

2.5 滋味相关化合物

乳制品的风味包括气味和滋味。气味由挥发性风味化合物经由鼻腔感知，而滋味则多为不挥发风味化合物，入口后主要在口腔中被感知。两者比例约为75∶25。因此，除了气味之外，滋味对风味也有重要作用。在发酵黄油中，涉及的滋味化合物主要包括氨基酸、有机酸、低分子量肽和水溶性矿物盐等。其中，氨基酸和小肽（300～400 u）的浓度如果超过感官阈值，可能会导致苦味、鲜味等异味[27]。

3 发酵黄油风味相关研究进展

3.1 风味化合物的保留特性及相互作用

发酵黄油基质的复杂性决定了对风味的研究必须考虑到大分子之间的相互作用。挥发性风味化合物从基质到空气中的释放特性很大程度上取决于它们与食物基质中存在的非挥发性化合物的相互作用[28-29]。不同大分子的性质（如蛋白质、脂质和水胶体等）和数量，都会影响香气的释放[30]。目前发酵黄油中缺乏针对风味化合物互作的研究，公开发表的相关文献一般涉及人造奶油[31]、奶油[32]、奶酪[33-34]等固体乳制品或者油-水等理论模型[35-36]。

脂质是与风味相关关键香气的形成基质和保留剂，同时也是对疏水挥发性化合物在介质和空气中的分配影响最大的食品成分[37]。这一点在脂肪含量较高的乳制品中现象更为明显。比如天然奶酪中通常含有20%～30%以上的脂质，Lauverjat 等[38]通过增加脂肪含量，观察到风味物质中己酸乙酯的空气-食品介质分配系数和扩散系数均有降低；而对于双乙酰则观察不到任何影响。造成这个现象的原因就是这两种化合物在油相介质中具有完全不同的分配系数。此外，脂肪含量的改变也会影响脂肪/蛋白质的比例，这将强烈影响乳制品的微观结构[39]，从而进一步影响其中香味化合物的释放。

关于蛋白质对乳制品香气释放的影响，有一些研究表明[40]，与平衡状态下静态顶空测量的外部研究相比，乳制品中实际蛋白质对香味物质的保留较少。这可以用芳香化合物和蛋白质之间的疏水相互作用来解释。在这些互作机制下，蛋白质不仅释放了游离醛，还释放了部分结合醛。

Boisard 等[41]研究了盐、蛋白质和脂肪对内部香气释放的联合效应。由于分子相互作用，蛋白质含量的增加降低了强疏水性化合物壬烷-2-酮的释放速率。在奶酪模型中添加盐会导致酮的香气释放速率显著增加，但双乙酰则没有影响。如果奶酪在水相中的含盐量较高，将会触发香气更快速地从蛋白质相释放到口腔、鼻腔，从而导致更高的释放速率。

另外，基质中大分子降解的中间产物（如脂质等）也可能会直接或间接影响风味化合物。比如一项对烤羊肉脂质及风味的研究[42]就发现，两类甘油三酯TG（16∶0_18∶1_18∶1）和TG（18∶0_18∶0_18∶1）可能是结合芳香化合物的主要脂质。特异性脂质中的磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE），则主要有助于芳香化合物的形成。

另外，发酵黄油中涉及鼻受体的芳香化合物主要是脂溶性的，不仅来源于脂质分解，还来源于氨基酸和碳水化合物的分解代谢。这些化合物在不同种类的发酵黄油中以不同的组合形成风味。这种风味在一些具有特殊原料或工艺、或者发酵周期较长的发酵黄油中非常复杂，如北非地区发酵黄油smen[43]、土耳其发酵黄油yayik[44]、印度黄油类发酵乳制品makkhan[45-46]等。目前对这些特殊种类发酵黄油的风味研究尚未开展风味化合物互作层面的深入研究。

3.2 近年发酵黄油风味相关研究进展

总结近8 年（2014～2022 年）以来一些公开发表对发酵黄油风味的研究，涉及关键风味物质（key aroma compounds）或香气活性物质（aroma-active compounds），结果见表2。

随着科学分析仪器和方法的快速进步，对发酵黄油风味研究的广度和深度在扩大，取得的进展也更为广泛和深入。比如，Mallia 等[47]针对发酵黄油风味化合物中的某一类特定化合物—含硫化合物进行单独的具体研究，发现挥发性硫化物的浓度会影响其最终风味。更多研究则借助化学统计方法和软件工具（如SPSS、heatmap 等），对数量庞大的风味检测数据进行深入的数据分析，深入探索风味化合物与风味特征的联系，并从统计学角度研究它们与发酵菌株、工艺条件等风味影响因素之间的关系与相互作用[48-50]。

另一方面，除了对不同国家（地区）、不同动物来源发酵黄油的风味差异分析之外，不少研究倾向于传统工艺或者地域特定的某一类发酵黄油，如北非地区手工制作的发酵黄油”smen”。这种传统发酵黄油使用天然发酵的混合菌种，且成熟时间较长（1～12 个月），具有较为多元的微生物多样性及丰富风味，因此成为近年来黄油领域的研究热点，围绕其开展关于工艺、菌种、理化特性等公开发表的论文也不断出现[43，48，50-51]。通过对这些地域性特殊发酵黄油的研究，深入分析对特征性风味物质（群）和关键微生物、关键工艺技术之间关系的研究，可能是未来提高发酵黄油风味、质量以及生产效率的突破性窗口。

4 结果与展望

综上所述，发酵黄油的丰富风味主要是由发酵菌株代谢产生的，是包含酸、酮、醛、内酯、硫化物等多种风味化合物不断变化、相互影响、共同作用的一个动态结果。其中，脂肪酸类的代谢不仅以最终产物游离脂肪酸的形式直接影响发酵黄油的风味，而且还作为中间产物参与诸如酸、醛等风味物质的代谢过程，是发酵黄油中最重要的风味相关化合物。检测方法和分析工具的迭代进步有助于发酵黄油风味研究的快速发展。近年来针对地域性特殊发酵黄油的风味分析研究相对较多，但放眼整个乳制品领域，目前对发酵黄油风味的研究还没有形成热点。展望未来发酵黄油风味研究的趋势，可能会从以下几个方面取得突破：(1)关键发酵微生物及其代谢特性，尤其是特殊类型或地域性发酵黄油；(2)芳香化合物与脂质、蛋白质等大分子及其次级降解产物的相互作用；(3)风味化合物在高脂基质中分布的特性研究，以及发酵过程对于黄油结构的衍生影响；(4)结合应用（如烘焙过程）开展的风味变化研究及相应的生产技术改良等。