四川部分地区鸡球虫流行病学调查及虫种鉴定

杨雪俪，吉克日洪，李菁菁，钟 莹，郝力力，张润慧

(西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041)

鸡球虫病系由顶复门的艾美耳属球虫(Eimeria)寄生在鸡的肠道黏膜上皮细胞内所引发的寄生性原虫疾病，该病呈全球性流行分布，雏鸡具有较高的发病率和病死率，且生长发育受到较大影响，而成年鸡大多为带虫者，影响其饲料转化率及产蛋量.即便是在鸡球虫病被治愈之后，也会由于球虫损伤了鸡体的消化道，使其无法彻底恢复健康，与无球虫感染史的健康鸡相比，生长发育的趋势较为缓慢[1].因此该病在全球养鸡业中造成了重大的经济损失，鸡球虫病每年给养鸡业带来超过100 亿英镑的损失[2].目前世界上公认的有7 种鸡艾美耳球虫，包括柔嫩(E.tenella)、毒害(E.necatrix)、堆型(E.acervulina)、巨型(E.maxima)、和缓(E.mitis)、布氏(E.brunetti)和早熟(E.praecox)艾美耳球虫[3]，这7 种球虫在病变部位、病变程度以及卵囊形态等方面都具有不同的特征，其中致病性最强的两种分别为柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫[4].

对球虫的虫种鉴定以往多采用传统形态学鉴定，即在光学显微镜下观察球虫卵囊以及孢子化卵囊的形状、颜色，大小，综合球虫的卵囊特征、寄生部位、病变特征、潜隐期等进行鉴定.但是，在传统形态学鉴定过程中影响因素较多，且田间多为混合球虫感染，镜检所耗时间较长，出错率高.第一内转录间隔区序列(Internal transcribed spacers-1，ITS-1)存在于高度重复的核糖体中，其基因序列的长度较短且进化速度较快，与传统鉴定方法相比，其敏感性强、准确度更高[5]，适用于寄生虫种间的遗传进化分析、虫种鉴定以及分类[6-7].本研究在2021－2022年从四川省9 个县市18 个养鸡场采集新鲜粪便样品，通过镜检确认各地区样品的阳性率，随后对球虫阳性样品进行形态学、PCR 分子生物学鉴定以及遗传进化分析，以了解这些地区鸡球虫流行情况.

1 材料与方法

1.1 样本来源

在2021－2022年于18 个养殖场中共采集152份粪便样品:四川省凉山州普格县(4 份)、四川省凉山州甘洛县(24 份)、四川省凉山州宁南县(32 份)、四川省凉山州喜德县(24 份)、四川省凉山州雷波县(8 份)、西昌市太和镇(32 份)以及资中市(8 份)、德阳市(17 份)、绵阳市(3 份)9 个县市的养鸡场中的鸡新鲜粪便.

1.2 主要试剂

琼脂糖、50×TAE、Easy Pure©Stool Genomic DNA Kit、2× Easy Taq©PCR SuperMix、Trans2K©Plus ⅡDNA Marker、GelStain 高灵敏度无毒核酸染料均为北京全式金生物技术股份有限公司产品；重铬酸钾粉剂购自天津市安吉瑞化工有限公司.

1.3 饱和食盐水漂浮法

采用饱和食盐水漂浮法对粪便样品分别进行检测，于光学显微镜下观察收集到的粪样中是否含有球虫.取少量的粪便( ＜5 g)，并加入近2 倍体积的清水捣碎混匀，用80 目和200 筛网滤掉粪渣[8]，取1 mL混匀液加入9 mL 饱和食盐水，静置15 min.取10 μL表面液体滴在载玻片上，压片镜检观察样品中是否有虫卵.

1.4 鸡球虫田间株卵囊纯化

将镜检观察确定为含有球虫卵囊的阳性粪便以1∶1 的比例加水混匀后立即用筛网过滤杂质，将滤液以3 000 r/min离心8 min，弃去上清液，再加入饱和食盐水混匀后继续以3 000 r/min离心8 min，取饱和食盐水漂浮液以1∶4 清水量稀释漂浮液后重复离心，直至将所有匀浆收集到1 个离心管中，最后取沉淀物收集于2.5%重铬酸钾溶液中，置于恒温摇床上培养96 h左右使其孢子化.

1.5 鸡球虫田间株形态学鉴定

在光学显微镜下观察纯化样品中孢子化球虫卵囊的形态、颜色、大小等，参照鸡球虫卵囊图谱[9-10]及相关文献资料[11]进行初步虫种鉴定.

1.6 鸡球虫卵囊DNA 的提取

在孢子化卵囊悬液中加入0.4～0.6 mm 玻璃微珠，充分涡旋使卵囊破碎后，按照DNA 提取试剂盒说明书提取球虫卵囊DNA，将其放至－20 ℃保存备用.

1.7 鸡球虫ITS-1 序列的PCR 扩增

根据参考文献[12-14]，合成ITS-1 基因通用型引物以及7 种鸡艾美耳属球虫的ITS-1 基因特异性引物，其中ITS-1 基因通用引物上游为:5′-AAGTTGCGTAAATAGAGCCCTC-3′；下游为:5′-CAAGACATCCATTGCTGAAAGT-3′，各球虫特异性引物见表1，引物均由上海生工生物工程有限公司合成.以提取的孢子化球虫卵囊DNA 为模板进行扩增，采用25 μL 反应体系:PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 9.5 μL.反应程序为:94 ℃，5 min(预变性)；94 ℃，30 s(变性)，在各特异性引物的退火温度下退火30 s(见表1)，72 ℃，22 s(延伸)，共35 个循环；最后在72 ℃下延伸7 min.取5 μL PCR 扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶中120 V 电泳30 min，在成像系统中观察结果并记录.

表1 各球虫特异性引物Table 1 Specific primers of each Eimeria species

1.8 序列测定和分析

将通用引物扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序.PCR 产物测序结果在GenBank 上进行BLAST 比对，并通过DNAStar 软件进行序列比较和分析，构建不同虫种间ITS-1 序列的系统发育进化树.

2 结果

2.1 镜检结果

镜检结果得出样品阳性率为0.7%(10/152)，从152 个粪样中筛选出10 份球虫阳性样品，分别来自普格县、雷波县、西昌市太和镇、德阳市和绵阳市，编号为W1、W2、W3、W4、LB、TH、DY、MY1、MY2、MY3.

2.2 卵囊的形态观察

于光学显微镜下观察到早熟艾美耳球虫(图1a)卵囊呈球形，大小约为16 μm×16 μm，柔嫩艾美耳球虫(图1b)呈现出宽卵圆形，卵囊大小约为21 μm×16 μm，卵囊壁较厚且呈现淡绿色，有一极粒.堆型艾美耳球虫(图1c)卵囊呈卵圆形，大小约为18 μm×13 μm，有一个极粒.布氏艾美耳球虫(图1d)在显微镜下观察呈宽卵圆形，具有一个极粒，卵囊大小约为22 μm×17 μm，其孢子囊形态呈现为长卵圆形.毒害艾美耳球虫(图1e)同样为卵圆形，但相较于堆型艾美耳球虫，其卵囊直径更大，约为20 μm×15 μm.7 种球虫卵囊中直径最小的是和缓艾美耳球虫(图1f)，为球形，约为15 μm×14 μm，且卵囊壁呈淡黄绿色.巨型艾美耳球虫(图1g)体型最大，卵囊大小约为31 μm×20 μm，呈卵圆形，其卵囊壁厚度较为不均匀，有两个极粒，见图1.

图1 孢子化艾美耳球虫卵囊(400×)Fig.1 Sporulated oocyst of Eimeria (400×)

2.3 PCR 扩增结果

将所提取的球虫DNA 为模板，根据7 种球虫特异性引物进行PCR 检测，结果显示:MY1 和W1 扩增出阳性条带的为毒害、早熟、布氏、巨型和柔嫩艾美耳球虫，W2 混合株扩增出阳性条带的为毒害、早熟、布氏和巨型艾美耳球虫，W3 混合株扩增出阳性条带的为早熟、布氏、巨型和柔嫩艾美耳球虫，LB 混合株扩增出阳性条带的为毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫，MY2 扩增出阳性条带的为毒害、早熟、布氏和柔嫩艾美耳球虫.TH 混合株扩增出阳性条带的为柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫，DY 混合株和W4 混合株扩增出阳性条带的为柔嫩、巨型及堆型艾美耳球虫，而MY 混合株扩增出阳性条带的为柔嫩和堆型艾美耳球虫(图2).其中毒害艾美耳球虫的条带大小范围在250～500 bp 之间，约为290 bp，早熟艾美耳球虫片段大小约为380 bp，布氏艾美耳球虫片段大小约为310 bp，柔嫩艾美耳球虫片段大小约为270 bp，巨型艾美耳球虫条带范围在100～250 bp 内，约为150 bp.通用引物PCR 扩增产物的琼脂凝胶电泳结果显示(图3)，10 个样品均扩增出阳性条带，大小范围为500～750 bp，约为600 bp.

图2 部分田间混合样品球虫种类PCR 鉴定结果Fig.2 Identification of coccidiosis species from the field by PCR

图3 部分通用型引物扩增电泳结果Fig.3 Electrophoresis of amplification by using general primers

2.4 序列测定及同源性比对结果

对10 个田间混合虫株分离株测序后，将所获得的序列在NCBI 中经过BLAST 后，其中MY1、MY2、W1、W2、W3、W4、LB 和TH 均与柔嫩艾美耳球虫ITS-1 的同一性达到最高，DY 序列与和缓艾美耳球虫序列同一性最高达到89.36%，MY3 与布氏艾美耳球虫ITS-1 序列同一性最高达到98.47%.选择与田间混合样品序列差异最小的虫种与不同地区的虫株进行比对确认(表2)，通过DNAStar 软件的CLUSTAL W，将其与不同种之间的ITS-1 序列进行同源性比较，分析结果见表3.除埃及地区的柔嫩Alexandria 分离株与柔嫩上海分离株(FJ449691) 和柔嫩Houghton 株(AF446075)同源性为75.1%和75.9%，其余柔嫩艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫的序列在虫株之间进行比较其ITS-1 序列一致性均大于80%.W1、W2、W3、W4、LB、MY1、MY2 和TH 与已登录GenBank 的柔嫩艾美耳球虫的序列一致性在96.6%～98.5%之内(除埃及地区柔嫩Alexandria 分离株).MY3 的ITS-1 序列与布氏艾美耳球虫最为相似，与布氏艾美耳球虫分离株TN11 之间的同源性最高，达93.3%.本研究对这10 个阳性样品之间ITS-1序列进行同源性比较，结果MY1 和TH 的相似性最大，达98.9%，MY3 和DY 与其他8 个序列的相似性均较小(42.7%～64.4%)，而与柔嫩艾美耳球虫最为相似的8 个样品之间进行ITS-1 序列同源性比较，同源性均在96.9%～98.9%之间.以上结果表明，每个地区所采集的样品中所包含的球虫种类存在一定的差异，除了MY3 和DY 外，另外8 个样品中柔嫩艾美耳球虫为优势虫种，而MY3 的优势虫种为布氏艾美耳球虫.

表2 艾美耳球虫ITS-1 基因序列信息(下载于GenBank)Table 2 The ITS-1 sequence information of Eimeria spp.(downloaded from GenBank)

2.5 ITS-1 序列系统发育树构建

应用DNAStar 软件，以Clustal W 法对5 个地区10 个样品中球虫ITS-1 及GenBank 上来自澳大利亚、埃及、南非、中国等不同地区的球虫分离株的ITS-1 部分序列构建系统发育进化树[15-16](图4).结果显示，无论地理位置如何，柔嫩艾美耳球虫、缓艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫的所有ITS-1 序列都存在明显的种间聚类.与柔嫩艾美耳球虫序列相似的8 个样品ITS-1 序列同4 个来自不同地区的柔嫩分离株均处于同一分支内，且8 个样品中ITS-1 序列遗传距离紧邻.E.brunettiMY3 与布氏艾美耳球虫分离株聚于一小支，遗传进化关系较近.E.mitisDY 虽然与其他地区的和缓艾美耳球虫分离株仍处于进化树的同一系群，但未聚于同一分支内，遗传距离较远.

图4 基于各虫株ITS1 基因构建的NJ 进化树Fig.4 Neighbor joining (NJ) phylogenetic trees based on the ITS1 of each strain

3 讨论

球虫传统的形态学鉴定法是通过显微镜下观察球虫卵囊以及孢子化卵囊的形状、颜色及大小，综合球虫的卵囊特征、寄生部位、病变特征、潜隐期等[17]，参照图谱进行种类鉴定.由于该方法仅需在显微镜下观察，所需仪器设备简单且结果呈现直接，目前仍是初步鉴定鸡球虫种类的常用方法.而通过PCR 扩增出艾美耳球虫DNA 序列中的特定片段，由于该方法具有特异性较强、效率高等优点，目前已广泛应用于球虫虫种鉴别.内转录间隔区是核糖体DNA 中18S和28S 之间的高度保守的序列，其中分为两段长度适中的基因序列，分别是ITS-1 和ITS-2，在种内具有较高的保守性，但在不同物种中的基因序列又呈现出不同程度的变异，进化速度敏捷[6]，所以已被广泛用于7 种鸡球虫的鉴定，同时被用来研究虫种间的系统发育进化关系.本研究利用Jenkins 等[13]设计的通用引物，对采自四川省凉山州普格县、西昌市太和镇、雷波县以及德阳、绵阳5 个县市的10 个样品进行ITS-1 序列的扩增和序列测定，结果发现不同样品之间ITS-1序列的同源性在42.7%～98.9%，其中MY3 和DY与其他8 个序列的相似性均较小(42.7%～64.4%).同时，将10 个样品ITS-1 序列分别与GenBank 上下载的不同地区的柔嫩、和缓和布氏艾美耳球虫进行比对分析，结果显示，W1、W2、W3、W4、MY1、MY2、LB 和TH 这8 个序列与4 株其他地区的柔嫩艾美耳球虫ITS-1 序列一致性均在96.6%～98.5%，而MY3 与布氏艾美耳球虫分离株TN11 之间的同源性最高，达93.3%，则本研究中大部分地区的优势虫种为柔嫩艾美耳球虫，而MY3 的优势虫种为布氏艾美耳球虫.

将田间混种球虫的ITS-1 序列与GenBank 上公布的ITS-1 序列进行比对发现，和柔嫩艾美耳球虫序列相似的8 个样品与不同地区的柔嫩分离株均处于同一分支内，亲缘关系较近，且8 个样品中ITS-1 序列遗传距离十分相近，序列差异较小.E.brunettiMY3 与布氏艾美耳球虫分离株遗传进化关系较近.在进行blast 比对时，与DY 显示同一性最高的是和缓艾美耳球虫，但其同一性仅达到89.36%，E.mitisDY 虽与其他地区的和缓分离株仍处于进化树的同一系群，但遗传距离较远，与柔嫩艾美耳球虫分离株聚于一个分支内，因此E.mitisDY 与其他和缓艾美耳球虫分离株相比，可能出现变异情况.从柔嫩艾美耳球虫分支对应同源性分析来看，可以得知埃及地区的分离株与其他地区分离株相比其进化距离较远，序列同一性相对较小.本研究调查的5 个地区养殖场内鸡球虫混种感染中虫种相似性较高，其可能与养鸡场的鸡源以及饲料等养殖材料的来源相同有关.

4 结论

本研究通过镜检从152 份粪样中检测出10 份球虫阳性样本，再通过形态学观察卵囊基本特征可初步确定样品均为混种球虫感染，并利用分子生物学检测方法进行虫种鉴定，采用特异性引物和通用引物进行PCR 扩增后，对通用引物扩增序列进行比对，确定W1和MY1 样品中感染的球虫种类为毒害、巨型、柔嫩、布氏和早熟艾美耳球虫，W2 样品中包含毒害、巨型、布氏和早熟艾美耳球虫，W3 中包括早熟、柔嫩、巨型和布氏艾美耳球虫，LB 混合感染毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫，MY2 中包括毒害、柔嫩、布氏和早熟艾美耳球虫，TH 样品包括柔嫩、毒害、堆型、巨型、早熟、和缓以及布氏7 种艾美耳球虫混合感染，MY、W4和DY 包括柔嫩、巨型、堆型、毒害、和缓以及布氏艾美耳球虫.