低共熔溶剂提取小球藻碳水化合物及提取液抗氧化性研究

陆伟东，李炜康，肖仔君

（1.韶关学院 化学与土木工程学院，广东 韶关 512005；2.韶关学院 食品学院，广东 韶关 512005）

小球藻（Chlorellasp.）是一类单细胞微生物. 小球藻能利用阳光和CO2进行光合作用，合成碳水化合物、蛋白质、脂肪和色素并释放出O2［1］. 与高等植物相比，小球藻具有生长速度快、碳水化合物产率高、可在废水和荒漠地培养等优点［2］. 小球藻碳水化合物是制备生物乙醇的理想原料［3］. 因此，近年来废水培养小球藻及提取小球藻碳水化合物是生物燃料领域的研究热点［4］. 目前，微藻碳水化合物提取方法主要有：硫酸溶液提取法［5］，微波、超声、臭氧辅助盐酸溶液提取法［6-8］，高压放电辅助溶剂提取法［9-10］，离子液体提取法等［11］. 与挥发性有机溶剂相比，离子液体具有低挥发性、高选择性和性质可调等优点. 但是离子液体的制备过程复杂，且大多存在生物毒性. 低共熔溶剂（Deep eutectic solvents，DES）是一类由氢键给体和氢键受体按一定的化学计量比组成的二组分或者三组分的凝固点明显低于各个组分纯物质熔点的低共熔混合物. DES 具有与离子液体相似的优点，同时DES 的制备过程简单、100%原子经济性、生物相容性也高于离子液体. 因此，DES 在生物质预处理及物质提取与分离［12］、绿色化学［13］、药物溶解［14］等领域展现出独特优势. 如在微藻生物质预处理辅助油脂提取方面，浙江大学课题组研究了DES 辅助水热法提取微藻油脂，证实DES 能促进微藻生物质解聚和溶解，进而提高油脂提取效率［15］. 笔者报道了用多种DES预处理小球藻生物质强化小球藻油脂提取，探究了DES 预处理强化小球藻油脂提取的微观机理［16］. 但是，适用于小球藻碳水化合物提取的DES、DES 提取小球藻碳水化合的影响因素及其机理和提取液抗氧化性尚未清楚. 笔者将从适用于小球藻碳水化合物提取的DES 筛选入手，考查提取的影响因素及其原因，并对DES 提取液的抗氧化性进行测定. 为进一步开发DES 在小球藻代谢物提取的应用提供技术支撑，也为DES 在其他生物活性物质的提取与分离提供借鉴.

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

主要材料有小球藻粉（购自青岛科海生物有限公司）、氯化胆碱、草酸、葡萄糖、抗化血酸等，所用试剂均为分析纯. 主要仪器有高速离心机（湖南湘仪）和紫外可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司）.

1.2 实验方法

（1）DES 制备：分别将氢键供体和氢键受体按照一定摩尔比加入圆底烧瓶中，在80 ℃恒温加热搅拌2 h 左右，得到无色透明液体，冷却至室温. 所有的样品使用前均先在80 ℃的真空干燥箱中干燥24 h.

（2）DES 提取小球藻碳水化合物：精准称量0.1 g 藻粉，按一定料液比加入DES 并置于水浴锅中加热.提取完毕后混合液离心（5 000 r·min-1，10 min）得上清液，上清液用于碳水化合物含量的测定.

（3）小球藻及DES 提取液中碳水化合物含量测定：小球藻及DES 提取液中碳水化合物含量测定参考Zhao 等的实验方法并作了一定的修改［7］. 具体步骤为：称取20 mg 左右小球藻粉，放置于10 mL 的玻璃离心管中，加入5 mL 0.5 mol·L-1的硫酸溶液，100 ℃条件下水解4 h，冷却至室温后离心（3 500 r·min-1，5 min），重复上述步骤3 次，所得上清液定容，用于小球藻总碳水化合物含量测定. 碳水化合物含量测定过程为：取样品，加入苯酚和浓硫酸溶液进行反应，显色后于490 nm 测定吸光度，计算出样品碳水化合物含量. 碳水化合物提取率为小球藻DES 提取液中碳水化合物含量与小球藻样品中碳水化合物含量的百分比.

（4）抗氧化性测定：小球藻DES 提取液、小球藻水提取液和抗坏血酸的超氧化物清除能力和羟基的清除能力测定参考孙利芹的实验方法进行［17］.

2 结果与分析

2.1 DES 筛选

DES 的结构决定了其物理化学性质，DES 的物理化学性质显著影响其对小球藻碳水化合物提取效率. 笔者合成了11 种DES 并将其用于小球藻碳水化合物提取. 同时作为对比，还测定了水和1 mol·L-1草酸溶液提取小球藻碳水化合物的提取率. 结果如图1 所示，DES 对小球藻碳水化合物的提取率在36.79%~79.41%之间. 其中氯化胆碱/草酸（1∶1，摩尔比，下同）对小球藻碳水化合物提取率最高（79.41%），高于相同提取条件下水的提取率（40.37%）和1 mol·L-1草酸水溶液的提取率（50.44%）. 其主要原因可能为氯化胆碱/草酸（1∶1）是强酸性DES 且能与小球藻细胞壁中的纤维素和半纤维素形成氢键，降低了纤维素和半纤维的键能，有利于小球藻细胞壁中的纤维素和半纤维素水解［16］. 因此，在后续实验中采用氯化胆碱/草酸（1∶1）来提取小球藻碳水化合物.

图1 不同DES 对碳水化合物的提取率

2.2 提取温度对碳水化合物提取率的影响

温度能显著影响化学反应速率和物质扩散速率. 固定反应时间为60 min，液固比20∶1（v/m，下同），分别测定温度为30、40、50、60、70、80 ℃时小球藻碳水化合物提取率. 由图2 可以看出，随着提取温度升高，DES 对小球藻碳水化合物的提取率显著增加. 提取温度为30 ℃时，提取率为51.60%. 当提取温度升至80 ℃时，碳水化合物的提取率为81.19%，提高了约30%. 其主要原因是随着提取温度的增加，小球藻细胞壁纤维素和半纤维素等碳水化合物快速水解. 同时，温度的提高也有利于小球藻细胞内碳水化合物向溶剂扩散［18］. 由于提取温度也是影响小球藻胞内物质稳定性和生物活性的主要因素，且提取温度是小球藻生物炼制能耗的主要部分. 因此，笔者不考查更高提取温度，后续实验的提取温度采用80 ℃.

图2 提取温度对提取率的影响

2.3 提取时间对碳水化合物提取率的影响

固定提取温度80 ℃，液固比20∶1，考查不同提取时间（10、20、30、40、50、60 min）对DES 提取小球藻碳水化合物效率的影响. 由图3 可知，随着提取时间从10 min增加至30 min，DES 对小球藻碳水化合物的提取率显著增加（从47.04%增加至72.47%）. 此结果与Yirgu 等采用微波辅助稀盐酸提取栅藻（Scenedesmussp.）碳水化合物相似［6］. 其主要原因是开始提取阶段，小球藻细胞碳水化合物含量与DES 相中碳水化合物浓度存在较大差异，有利于提取. 当提取时间超过30 min 后再进一步延长提取时间，DES 对小球藻碳水化合物提取率增加不显著. 主要原因是经过较长提取时间后，DES 相中碳水化合物的浓度增加明显，固液相碳水化合物的浓度差显著变小，碳水化合物向DES 相扩散的速率也显著降低［19］. 综合考虑提取率和提取成本，30 min 为较佳的提取时间.

2.4 含水量对碳水化合物提取率的影响

氯化胆碱/草酸（1∶1）在常温下黏度较高，不利于物质扩散. 因此，固定提取温度80 ℃，提取时间60 min，液固比20∶1，通过在氯化胆碱/草酸（1∶1）中加入不同质量分数的蒸馏水（5%、10%、15%和20%），考查蒸馏水的加入量对小球藻碳水化合物提取率的影响. 作为对照，同时也测定未加水的DES 对小球藻碳水化合物的提取率. 由图4 可以看出，未加水的氯化胆碱/草酸（1∶1）对小球藻碳水化合物的提取率为79.40%，蒸馏水添加量为5%时，提取率增加至81.13%. 当蒸馏水的添加量超过5%后，碳水化合物的提取率显著下降，当蒸馏水的添加量增加至20%时，碳水化合物的提取率仅为66.06%. 其主要原因是少量的蒸馏水加入可以降低DES 的黏度，有利于碳水化合物从藻细胞扩散到溶液相. 但是，过量的水加入DES，会破坏DES 的氢键结构，不利于DES 形成超分子结构并与藻细胞壁的纤维素、半纤维素形成氢键提高藻细胞壁的通透性［20］.

2.5 超氧化物的清除能力

超氧化物是含有超氧离子（O2-）的一类化合物.它是一种活性氧，若生物体内O2-产生过量或体内过氧化物歧化酶活力下降，都将会给机体造成损伤［21］.采用邻苯三酚在碱性条件下产生的O2-，并测定小球藻DES 提取液、小球藻水提取液和抗坏血酸水溶液对O2-的清除能力，结果如图5 所示. 可以看出，随着小球藻DES 提取液质量浓度提高，其超氧化物清除率快速增加，当小球藻DES 提取液为0.2 mg·mL-1时，超氧化物清除率为97.56%，继续增加小球藻DES 提取液质量浓度，超氧化物清除率变化不显著. 此外还可以看出，小球藻DES 提取液的超氧化物清除率均比相同质量浓度下的小球藻水提取液和抗坏血酸水溶液的超氧化物清除率高. 其主要原因是DES 提取液对小球藻碳水化合物的提取率要显著高于水的提取率，而小球藻多糖中存在大量的羟基和硫酸基团，可与O2-反应，从而清除O2-［21］.

图5 超氧化物的清除率

2.6 羟基的清除能力

羟基自由基（·OH）具有极高的氧化活性. 它能引起生物体的病变. 因此，·OH 清除率常被用于评价抗氧化剂的抗氧化性［21-22］. 分别对不同质量浓度的小球藻DES 提取液和抗坏血酸的清除自由基效率进行了测定，结果如图6 所示. 可以看出，当小球藻DES 提取液的质量浓度低于0.5 mg·mL-1时，提取液对羟基自由基清除率呈缓慢增加的趋势，且小球藻DES 提取液对羟基自由基的清除率与同质量浓度的抗坏血酸对羟基自由基的清除率相当. 当小球藻DES 提取液的质量浓度高于0.5 mg·mL-1时，提取液对羟基自由基清除率显著增加，小球藻DES 提取液对羟基自由基的清除率显著高于同质量浓度的抗坏血酸对羟基自由基的清除率. 当小球藻DES 提取质量液浓度为3.2 mg·mL-1时，其对羟基自由基的清除率高达93.38%，同质量浓度的抗坏血酸对羟基自由基的清除率仅为28.14%.

图6 提取液对羟基自由基的清除能力

3 结论

当提取温度为80 ℃，提取时间为60 min 和水添加量为5%时，氯化胆碱/草酸（1∶1）低共熔溶剂对小球藻碳水化合物的提取率达到81.3%，显著高于水提法的提取率（40.37%）. 此外，小球藻氯化胆碱/草酸（1∶1）提取液的超氧化物清除能力和自由基清除能力也显著高于同质量浓度的小球藻水提取液和抗坏血酸的超氧化物清除能力和羟基清除能力. 但是，由于低共熔溶剂的沸点与常规溶剂相比较高，回收存在一定的困难，因此仍需对目标化合物分离与纯化进行进一步的研究.