基于网络药理学及实验验证研究地黄饮子防治阿尔茨海默病作用机制

王金龙，王艺蓉，李景全，闫黎，王昊，刘晴，张永芳，董杨

1. 上海中医药大学中西医结合学院，上海 201203

2. 上海中医药大学中医学院，上海 201203

3. 上海交通大学医学院药理学与化学生物学系，上海 200025

阿尔茨海默病（AD）是由多种原因引起的一种复杂的神经退行性疾病，会导致患者记忆障碍、学习能力下降、人格和行为改变等[1]。其发病机制尚不十分清楚，主要涉及淀粉样蛋白假说、神经递质假说、神经炎症假说等[2]。目前治疗AD 的药物利凡斯的明、多奈哌齐、美金刚等虽然可以一定程度的减轻认知障碍等症状，但都无法真正抑制、逆转病情进展[3]。地黄饮子作为经典的中药方剂之一，具有补肾填精、化痰开窍的功效，切中AD 的中医病机。有临床研究显示，地黄饮子能够改善AD 患者学习记忆及认知功能障碍[4]，但其具体作用机制仍不十分清楚。本研究通过网络药理学探讨地黄饮子防治AD 的潜在机制，并结合整体动物实验进行验证。

1 材料与方法

1.1 地黄饮子有效成分搜集利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/）搜集熟地黄、山茱萸、巴戟天、肉苁蓉、肉桂、五味子、附子、茯苓、石菖蒲、生姜、大枣、薄荷的化学成分，根据药代动力学相关信息筛选有效成分。设置条件为口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，血脑屏障（BBB）≥-0.3[5]；TCMSP 中未包含的中药远志、石斛、麦冬则通过HERB 数据平台（http：//herb.ac.cn/）进行化学成分搜集，利用pkCSM 数据平台（http：//biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/）对成分进行分析，收集BBB≥-1 并且满足Lipinski's法则（LR）中至少4 项的作为有效成分[6]；此外，通过文献检索纳入部分不符合上述筛选条件但有文献报道具有抗AD 活性的有效成分。

1.2 有效成分靶点预测与疾病靶点获取通过TCMSP、SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、STITCH（http：//stitch.embl.de/）获取有效成分潜在靶点。其中SwissTargetPrediction 数据库中选取概率值≥0.5 的预测靶点，STITCH 数据库中选取置信分数≥0.7 的预测靶点。利用Therapeutic Target Database（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）、Gene-Cards（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）3 个数据库以“Alzheimer's disease”为关键词获取AD 相关靶点。其中DisGeNET数据库选取score≥0.3 的靶点，GeneCards 数据库选择score≥20 的靶点。

1.3 网络构建与拓扑分析将地黄饮子和AD 相关靶点导入 bioinformatics 在线工具（http：//www.bioinformatics.com.cn/）Venn 图模块，获取交集靶点。利用Cytoscape 3.7.1 软件构建“中药-成分-靶点”网络，CytoNCA 功能模块对网络进行拓扑分析。网络中的节点代表化学成分、靶点或者中药，边表示它们之间的连接，“Degree”用来计算连接到每个节点的边的数量，“Degree”值越高表示给定节点在网络中越重要[7]。

1.4 GO 及KEGG 通路富集分析利用Metascape在线工具对关键靶点进行GO 和KEGG 通路富集分析，并利用bioinformatics 将结果可视化，P值＜0.05的富集条目具有显著统计学差异。

1.5 实验验证

1.5.1 实验动物8 周龄SPF 级雄性C57BL/6 小鼠40 只，体质量（22±2）g，均购自上海灵畅生物科技有限公司，实验动物[许可证号：SYXK（沪）2018-0027]饲养于标准条件下[室温控制在（24±2）℃，12 h 黑暗/光照]，可自由进食和饮水。实验通过上海交通大学医学院伦理审批（A-2021-019）。

1.5.2 药物及制备地黄饮子处方：熟地黄18 g，山茱萸、巴戟天、肉苁蓉、石斛各9 g，附子、五味子、肉桂、茯苓、麦冬、石菖蒲、远志各6 g，薄荷2 g，生姜5 片，大枣1 枚。按处方剂量称取药材加入8 倍体积的水，砂锅中浸泡12 h，大火煮沸，转文火0.5 h；重复煎煮1 次，合并药液，过滤、浓缩至1.32 g/mL，4 ℃保存备用。中药饮片均购自上海康桥中药饮片有限公司。

1.5.3 试剂与仪器小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、小鼠白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司，批号：EK282、EK206）；乙酰胆碱酯酶（AChE）ELISA 试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：EEL-M2637c）；核因子κB（NF-κB）、磷酸化核因子κB（p-NF-κB）（Cell Signaling Technology 公司，批号：3033S、8242S）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 抗体（碧云天生物技术有限公司，批号：A0208）；氢溴酸东莨菪碱（批号：xw080081），购自国药集团化学试剂有限公司。Y 迷宫设备购自张家港市生物医学仪器厂，新物体识别设备、水迷宫设备购自上海移数信息科技有限公司。

1.5.4 动物分组与给药实验将小鼠随机分为4 组，每组10 只。分别为对照组、模型组、地黄饮子低剂量（6 g/kg）组和高剂量组（12 g/kg）。地黄饮子的剂量根据临床等效剂量进行换算[8]。小鼠适应环境5 d后，地黄饮子低、高剂量组分别按照6 g/kg 和12 g/kg灌胃24 d（直到行为学实验结束），对照组和模型组同时灌胃等量0.9 % 氯化钠溶液。在中药灌胃14 d后，模型组和地黄饮子低、高剂量组按照3 mg/kg 腹腔注射剂量东莨菪碱，对照组腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液，30 min 后进行行为学实验[9]。

1.5.5 Y 迷宫实验用Y 迷宫观察小鼠自发交替行为，不设置奖励或惩罚，评估小鼠短期空间工作记忆[10]。迷宫架分为3 个臂（30 cm×8 cm×15 cm），夹角为120°。将小鼠随机置于1 个臂，进入每1 个臂且不同于前2 个臂则标记为正确选择（例：A-B-C 或A-C-B），否则标记为错误选择。自发交替行为=正确进臂次数/（总进臂次数-2）×100%。

1.5.6 新物体识别实验Y 迷宫实验结束后第2 天进行新物体识别实验，评估小鼠对新旧物体的识别记忆能力[11]。第1 天适应阶段，小鼠在实验箱中自由活动5 min。第2 天熟悉阶段，在箱底部一条对角线上间隔相同距离放置2 个相同物体，小鼠面朝实验箱壁放入，自由活动5 min，期间记录小鼠对2 个物体的探索次数。第3 天测试阶段，用1 个新物体替换旧物体，同样方法放入箱体并自由探索5 min，记录小鼠分别对两物体的探索次数。识别指数（RI）=探索新物体次数/（探索新物体次数+探索旧物体次数）×100%。

1.5.7 Morris 水迷宫实验新物体识别实验结束后第2 天进行水迷宫实验，评估小鼠学习和空间记忆能力[12]。水迷宫系统由摄像记录设备和圆形水池组成。水面分为4 个象限，平台置于第Ⅱ象限水下1 cm，依次从第Ⅰ～Ⅳ象限放入小鼠。定位航行阶段，记录60 s 内小鼠寻找平台所需时间，即逃避潜伏期，每天每个象限各训练1 次。第6 天撤掉平台进行空间探索实验，记录60 s 内小鼠在目标象限停留时间。

1.5.8 ELISA 检测AChE 及相关促炎细胞因子水平行为学实验全部结束，处死小鼠。将小鼠海马组织匀浆于混有PMSF 的4 ℃预冷的PBS 中（质量∶体积=1∶9），12 000 r/min 离心15 min 后取上清，按照ELISA 试剂盒说明检测AChE、IL-6、TNF-α 的水平。

1.5.9 Western Blot 检测NF-κB、p-NF-κB 蛋白表达将小鼠海马组织匀浆于含有PMSF 和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液中，离心后取上清，BCA 法测定蛋白浓度。将等量的蛋白在SDS-PAGE 凝胶上电泳分离，将蛋白转移到PVDF 膜（Millipore）上，快速封闭液封闭1 h 后加入NF-κB 和一抗（1∶1 000，CST）4 ℃孵育过夜，洗膜3 次，每次10 min，二抗室温孵育2 h，采用ECL 化学发光剂显影，Image Studio Lite软件对蛋白条带进行灰度值分析并定量。

1.6 统计学方法使用GraphPad Prism 8.0.2 版本对上述实验结果进行统计分析。数据用均数±标准差（）表示。数据符合正态分布并通过方差检验后，使用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Bonferroni 检验进行多组间比较。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 地黄饮子有效成分及靶点信息见图1。利用TCMSP、HERB 数据平台筛选有效成分。剔除未获得潜在靶点的成分后剩余89 个有效成分，文献检索补充50 个有效成分，共获得地黄饮子有效成分139 个。结合TCMSP、SwissTargetPrediction 和STITCH 数据平台获得上述有效成分对应的832 个潜在靶点。从TTD、DisGeNET、GeneCards 数据平台共获取570 个AD 相关靶点，取地黄饮子与AD 共有靶点197 个，即地黄饮子防治AD 的潜在靶点。

图1 地黄饮子与AD 共有靶点Venn 图

2.2 共有靶点的网络构建与分析见图2、表1。利用Cytoscape 3.7.1 构建“中药-成分-靶点”网络，该网络共包含339 个节点，涉及1 336 条边，其中123 个中药化学成分节点连接了197 个AD 相关靶点。利用网络拓扑分析上述网络节点之间的联系，根据中位数度值进行限定，获得61 个地黄饮子防治AD 的关键有效成分，展示其中度值最高的前20 个成分。对关键有效成分对应靶点进行中位数度值限定，获得度值最高的前106 个靶点，作为地黄饮子防治AD 的关键靶点。

表1 地黄饮子关键有效成分TOP 20

图2 地黄饮子防治AD 的中药-成分-靶点网络

2.3 地黄饮子防治AD 关键靶点GO 及KEGG 通路富集分析见图3。GO 分子功能富集分析结果显示，关键靶点与肽结合（淀粉样蛋白）、胆碱能结合、神经递质受体的活动等有关；GO 生物过程富集分析结果表明，这些靶点主要与炎症反应的调节、行为活动调控等相关。KEGG 通路富集分析结果发现，关键靶点主要富集在AD、胆碱能突触、NF-κB等与AD 相关的信号通路中，其中胆碱突触通路富集靶点有AChE、CHRNA7 等；NF-κB 通路富集的靶点有TNF、RELA 等。

图3 地黄饮子防治AD 关键靶点富集分析

2.4 地黄饮子对AD 小鼠短期空间工作记忆的影响见表2。Y 迷宫实验结果显示，模型组较对照组小鼠迷宫臂的正确选择次数降低（P＜0.05），地黄饮子低剂量和高剂量能够增加AD 模型小鼠的正确交替行为（P＜0.05）。提示地黄饮子可以改善小鼠短期空间工作记忆能力。

表2 地黄饮子对AD 小鼠短期空间工作记忆的影响（）

表2 地黄饮子对AD 小鼠短期空间工作记忆的影响（）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与模型组比较，P＜0.05

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2.5 地黄饮子对AD 小鼠识别记忆的影响见表3。熟悉阶段各组小鼠对2 个相同物体的识别指数约50%，组间无显著差异，提示各组小鼠对2 个相同物体的位置及环境无选择性偏好。新物体识别测试阶段，模型组小鼠对新物体识别能力下降（P＜0.05）；与模型组比较，地黄饮子低剂量和高剂量组给药后小鼠对新物体识别指数均升高（P＜0.05）。表明地黄饮子能够一定程度改善AD 模型小鼠对新物体和旧物体的识别记忆能力，恢复小鼠对新物体的正常偏好。

表3 地黄饮子对AD 小鼠识别记忆的影响（） %

表3 地黄饮子对AD 小鼠识别记忆的影响（） %

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与模型组比较，P＜0.05

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2.6 地黄饮子对AD 小鼠学习及空间记忆能力的影响见图4。在5 d 的定位航行训练过程中，各组小鼠找到平台的逃避潜伏期逐渐缩短；第5 天，模型组小鼠的逃避潜伏期相较于对照组增加（P＜0.05），与模型组相比，地黄饮子低、高剂量组的逃避潜伏期缩短（P＜0.05）；空间探索阶段，模型组小鼠与对照组小鼠相比目标象限活动时间减少（P＜0.05），地黄饮子高剂量组小鼠目标象限停留时间增加（P＜0.05）。以上结果表明，地黄饮子可以改善AD 模型小鼠学习和空间记忆能力。

图4 地黄饮子对AD 小鼠学习及空间记忆能力的影响（，n=7）

2.7 各组小鼠海马组织中AChE 及促炎细胞因子比较见表4。ELISA 检测结果显示，模型组AChE 的水平高于对照组（P＜0.05），地黄饮子低、高剂量组AChE 的水平低于模型组（P＜0.05）。模型组IL-6、TNF-α 水平高于对照组（P＜0.05），地黄饮子高剂量组IL-6 水平低于模型组（P＜0.05），低、高剂量组TNF-α 水平低于模型组（P＜0.05）。提示“胆碱能抗炎途径”可能与地黄饮子改善小鼠认知功能障碍有关。

表4 各组小鼠海马组织中AChE 及促炎细胞因子比较（）

表4 各组小鼠海马组织中AChE 及促炎细胞因子比较（）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与模型组比较，P＜0.05

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2.8 各组小鼠海马组织中磷酸化NF-κB 蛋白表达比较见图5、表5。Western Blot 检测结果表明，模型组p-NF-κB 蛋白表达高于对照组（P＜0.05）。低、高剂量地黄饮子均可以降低p-NF-κB 蛋白的表达（P＜0.05）。

表5 各组小鼠海马组织中磷酸化NF-κB 蛋白表达比较（）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与模型组比较，P＜0.05

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3 讨论

本研究基于网络药理学分析发现地黄饮子防治AD 有效成分中度值较高的包括槲皮素、芹菜素、染料木素、反式肉桂醛等。有研究表明，槲皮素具有神经保护作用，包括抑制AChE 和BChE 活性，减轻胆碱能系统功能障碍[13]。芹菜素、染料木素能够调节胆碱能系统，对α7 烟碱乙酰胆碱受体（α7nAChR）具有正向变构调节的作用，抑制TFN-α、IL-6 的产生[14-15]。反式肉桂醛是肉桂中的一种醛类有机化合物，Zhao Y 等[16]发现其可以阻断NF-κB 的激活，抑制神经炎症反应，改善早老素1 和2 条件双敲除（PS cDKO）小鼠认知功能障碍。GO 和KEGG 通路富集分析表明，地黄饮子防治AD 的关键靶点参与肽结合（淀粉样蛋白）、胆碱能结合、炎症反应调节、行为活动调控等；AChE、CHRNA7、RELA、TNF 等关键靶点富集于胆碱能突触、NF-κB 等与AD 相关的信号通路中。提示地黄饮子防治AD 的作用与调控胆碱能和神经炎症途径有关。

东莨菪碱是一种公认的抗胆碱能药物，常被用作诱发动物认知障碍的实验标准药物[17]。本研究借助东莨菪碱诱导小鼠AD 模型，通过行为学实验发现地黄饮子可以有效改善小鼠的认知功能障碍。胆碱能突触普遍存在于人类的中枢神经系统，胆碱能传递在学习记忆和其他高级大脑功能中发挥着重要的作用。有研究表明，配体门控的α7 烟碱乙酰胆碱受体（α7nAChR）是炎症反应的效应点，参与突触功能、神经保护、神经元存活和炎症反应的调节[18]。迷走神经通过主要的神经递质乙酰胆碱（Ach）调节α7nAChR 在炎症细胞中的激活减弱TNF-α、IL-6 等促炎细胞因子的释放，这种效应被称为“胆碱能抗炎途径”[19-20]。存在于胆碱能突触间的AChE 是生物神经传导中的一种关键性酶，可将ACh 水解成胆碱和乙酸。一旦胆碱能系统功能障碍，AChE 与ACh 之间平衡被打破，“胆碱能抗炎途径”将遭到破坏。而胆碱酯酶抑制剂可以抑制AChE，防止ACh 的分解，进而保护胆碱能突触的活性[21]。本研究发现，地黄饮子能够显著降低东莨菪碱AD 模型小鼠海马组织中异常升高的AChE 水平，可能恢复“胆碱能抗炎途径”。

胆碱能抗炎途径能够通过影响促炎细胞因子的产生与释放，以及抑制NF-κB 的活化发挥作用。NF-кB 是细胞内重要的核转录因子，能够引起胶质细胞激活，增加炎症介质的释放并进一步诱发神经炎症[22]。有研究表明，NF-κB 通路参与神经炎症的调控，与认知功能的损伤有关[23]。本研究中发现，地黄饮子可以降低AD 小鼠海马组织中IL-6、TNF-α水平以及p-NF-κB 蛋白的表达水平，提示地黄饮子可能通过抑制NF-κB 蛋白的磷酸化进而抑制神经炎症反应。

综上，本研究通过网络药理分析结合动物实验验证发现，地黄饮子可以改善东莨菪碱AD 模型小鼠的认知功能障碍，其作用机制可能是通过抑制小鼠海马AChE 的水平，减轻胆碱能损伤，抑制NF-κB介导的神经炎症，恢复“胆碱能抗炎途径”，从而改善小鼠认知功能障碍。