2013—2021年杭州某综合医院非结核分枝杆菌肺病流行状况分析

韩佳颖，覃瑶，何飞

2013—2021年杭州某综合医院非结核分枝杆菌肺病流行状况分析

韩佳颖1，覃瑶2，何飞1

1.浙江大学医学院附属杭州市胸科医院呼吸与危重症医学科，浙江杭州 310003；2.浙江大学医学院附属杭州市胸科医院结核科，浙江杭州 310003

分析杭州市结核病定点诊治医院2013—2021年非结核分枝杆菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）肺病的流行状况，为杭州市该病的临床防治诊疗及流行病学提供依据。收集2013—2021年浙江大学医学院附属杭州市胸科医院结核科及呼吸与危重症医学科收治的疑似肺结核患者，经抗酸杆菌涂片及BACTEC MGIT960确诊为分枝杆菌感染，采用实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测结核分枝杆菌复合群（tuberculosis complex，MTB）与NTM的菌群鉴定，对鉴定为NTM的菌株采用HAIN基因分型鉴定法及DNA微阵列技术进行菌种鉴定，并对感染者的相关资料进行总结分析。2013—2021年，从37 520例疑似肺结核患者标本中分离出NTM菌株1257株，检出率从2013年的0.8%上升到2021年的6.7%。患者中男性占50.76%，女性占49.24%。年龄分布上，60～79岁的中老年患者最多，占55.0%。2013年检出3种NTM菌种，分别是胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和龟/脓肿分枝杆菌；2021年菌种分布达13种，前三位分别是胞内分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌。2013—2021年杭州地区NTM检出率持续升高，感染人群以男性、60～79岁的中老年为主，感染菌种以胞内分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌为主。

分枝杆菌；非结核分枝杆菌；菌种鉴定；疾病特征；流行病学

非结核分枝杆菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）是除结核分枝杆菌复合群（tuberculosis complex，MTB）和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌的总称，目前共发现有菌种约190余种，14个亚种，大多数为条件致病菌[1]。近年来，NTM感染在欧美国家和包括我国在内的亚洲国家的发病率均逐渐上升，已逐步成为威胁人类健康的重要公共卫生问题[2-3]。目前国内尚缺乏大样本NTM病的流行病学调查资料，了解NTM病的趋势和流行对疾病诊治和防控至关重要[1]。本研究对2013—2021年杭州市一家定点结核病诊疗中心分离培养的NTM菌株进行分析，以了解该市NTM的菌种分布、流行状况，为本病的防治诊疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象及菌株来源

通过调查电子病历系统、检验系统的数据，收集2013年1月至2021年12月浙江大学医学院附属杭州市胸科医院结核科及呼吸与危重症医学科收治的37 520例疑似肺结核患者，对萋–尼氏染色法染色及MGIT960分枝杆菌快速培养阳性者，采用实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测进行MTB与NTM的初步菌群鉴定，对鉴定为NTM的菌株应用HAIN基因分型鉴定及DNA微阵列菌种鉴定，同一患者多次培养得到同一种分枝杆菌按重复菌株剔除。MTB质控菌株（标准菌株）H37Rv（ATCC27294）、胞内分枝杆菌（ATCC13950）、鸟分枝杆菌（ATCC25291）、脓肿分枝杆菌（ATCC19977）、堪萨斯分枝杆菌（ATCC12478）、龟分枝杆菌（ATCC35752）、偶然分枝杆菌（ATCC6841）均来源于中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室传代培养。NTM病诊断标准参照指南[1]。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂 萋–尼氏染色试剂购自珠海贝索生物技术有限公司；BACTEC MGIT960分枝杆菌分析系统（MGIT 960）及其配套试剂MGIT试管、杂菌抑制剂均购自美国BD公司；HAIN基因分型试剂盒（CM/AS）购自德国HAIN Lifescience公司；分枝杆菌核酸检测试剂盒、分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（DNA微阵列芯片法）购自北京博奥生物有限公司。所有试剂均在有效期内使用。

1.2.2 仪器 生物显微镜（日本奥林巴斯公司）、低温离心机（德国EPPENDORF公司）、荧光定量PCR仪（美国Roche公司）、全自动结核杆菌培养箱（美国BD公司）、HybSet微阵列芯片杂交仪、芯片洗干仪、微阵列芯片扫描仪均购自北京博奥生物集团有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 MGIT960培养 按照《结核病实验室诊断技术培训教程》[4]进行，对临床分离株进行萋-尼抗酸涂片染色检测是否存在抗酸杆菌，采用自动化的BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养液快速培养，通常在2～4周内报告阳性结果“分枝杆菌生长”，在42d后报告阴性结果。

1.3.2 PCR荧光探针法初步鉴定 按照结核菌和非结核分枝杆菌实时PCR检测试剂盒说明，采用双重PCR技术和Taqman探针技术相结合，对标本中提取的分枝杆菌核酸进行定性检测。分别针对MTB和NTM的特异性序列设计引物和探针，两探针分别标记对应的荧光发光基团。检测时，当反应体系中有目的基因存在时，就会释放出荧光。通过监测FAM及HEX两通道不同的荧光信号变化，进而实现对MTB和NTM的检测。结果判定见表1。

表1 PCR荧光探针法检测结果及解释

1.3.3 菌种鉴定 2013—2016年，将培养阳性菌种经HAIN基因组试剂盒提取DNA，扩增200bp片段的23SrRNA；杂交及显色操作过程参照试剂盒说明书，示例见图1。2017—2021年，采用DNA微阵列芯片法鉴定培养阳性菌种，将杂交缓冲液和PCR产物吹扫并混合。再将混合物添加到采样孔中，进行洗涤和干燥芯片，采用微阵列芯片扫描仪进行扫描和相应软件进行信号读取，所有NTM菌株都获得一张清晰的芯片图，示例见图2。

图1 HAIN基因分型试剂盒菌种鉴定杂交示例图

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行分析，计数资料以例数（百分率）[（%）]表示，比较采用2检验，<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各年度NTM菌株检出情况

对37 520份标本进行检测，2013—2016年共分离培养出4种NTM，分别为胞内分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌，共计245株。2017—2021年共分离培养出12种NTM，分别为胞内分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、偶然分枝杆菌、戈登分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、田野分枝杆菌、土分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌株共计1012株，NTM的总分离率为3.4%，具体见图3和表2。

图3 患者纳入及实验室检测流程图

2.2 NTM患者的性别、年龄分布

2013—2021年杭州市NTM感染患者中，男性占50.76%，略高于女性的49.24%。患者年龄7～98岁，平均62.8岁。各年度感染者及男、女性感染者的年龄分布均以60～79岁组最多，具体见表3、表4。2013—2021年，男女构成比变化趋势差异有统计学意义（2=8.218，=0.003），NTM年龄构成比变化趋势差异有统计学意义（2=5.144，=0.023）。

表2 2013—2021年NTM检出情况

2.3 NTM菌种分布

2013年分离出NTM 31株，共鉴定出胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌3种菌种，有1例MTB及NTM共存；2014—2016年分离出NTM共214株，前三位分别为胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌；2017年共分离出NTM 50株，鉴定出8种NTM，前三位分别为胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌；2018年105株共鉴定出8种NTM，前三位分别为胞内分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌；2019年296株共鉴定出9种NTM，前三位分别为胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌；2020年共检出NTM 283株，包括12种类型，菌种前三位分别为胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌；2021年共检出NTM 278株，包括12种类型，前三位分别为胞内分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌，分别占45.7%、15.5%、12.2%，其余还有少许堪萨斯分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、偶然分枝杆菌、戈登分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、田野分枝杆菌、土分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌菌株。

表3 NTM患者不同特征在2013—2021年的分布情况[n（%）]

表4 2013—2021年各年龄组NTM患者在不同性别中的分布情况

3 讨论

3.1 NTM分离率

我国目前尚没有关于NTM的大样本流行病学调查资料[1,5]。既往研究显示，我国NTM分离率由1979年的4.3%上升至2010年的22.9%，呈明显的上升态势[6]。一项荟萃分析指出，在中国疑似结核患者中，NTM的分离率为4.66%～5.78%，分枝杆菌中NTM的分离率为11.57%[7]。

NTM的分离率在我国的东南沿海地区高于其他地区[8]。本研究结果显示杭州地区2013—2021年总分离率为3.40%，低于2010年流行病学抽样调查的22.90%、北京市37.30%、广州市24.20%、绍兴市10.90%、湖南省10.20%、福建省6.35%、深圳市4.10%[6,9-14]。本研究2021年NTM的分离率为6.7%，与重庆市5.7%、上海市5.9%相近，高于云南的1.6%[15-17]。NTM的流行及检出有显著的地域差异，提示不同地区需根据当地疫情作出相应的防控策略。

3.2 NTM在人群中的分布

NTM的发病与年龄呈正相关，在湖南省14个地级市的年龄分布中，40岁以上的中老年患者最多，占39.2%[12,18]；南京地区50岁以上的患者男性占68.6%，女性占77.8%[19]；深圳地区患者主要年龄段以55岁以下的青壮年为主，占84.5%，且男、女性患者的分布峰值均以25～34岁年龄组最多，可能与当地的人口结构有关[14]。韩国男性患者主要集中在60和70多岁，而女性患者则更年轻一些，平均62.7岁[20]。新加坡患者的中位年龄为67岁[21]。美国65岁以上的患者年患病率也明显高于其他年龄段[19]。本研究中NTM感染者的男女性分布峰值均在60～79岁，与文献报道一致。

3.3 NTM种群分布比较

NTM为环境细菌，菌种分布具有地域差异性，可能与当地的地理位置、气候、生活环境、实验室条件等密切相关[7]。在南京、北京、湖南等地胞内分枝杆菌是最常见的致病菌，分别占70.1%、31.8%、27.2%[9,12,19]；上海、伊朗最常见的是堪萨斯分枝杆菌，分别占45.0%、30.5%[16,22]；深圳、新加坡、广东最常见的是脓肿分枝杆菌，分别占41.6%、49.9%、48.8%[14,21]。而MAC作为大多数国家（地区）的主要菌种，在澳大利亚、韩国、亚洲、北美、南非、欧洲和南美洲所占比例分别为71.1%、63.6%、53.8%、52.0%、50.5%、36.9%、31.3%[20,23]。

有研究指出，在中国2015年之前最流行的菌种是脓肿分枝杆菌，2015年后则为胞内分枝杆菌[7]。本研究经菌种鉴定NTM种群分布达13种，2013—2021年最常见的均为胞内分枝杆菌，与部分文献内容契合。

3.4 NTM菌种鉴定的重要性

NTM感染后可产生与MTB相似的症状、体征和影像改变，目前大部分基层医院依然使用抗酸染色作为诊断MTB的方法。但在无菌种鉴定结果的情况下，抗酸染色不能有效区分两者，故不少NTM患者被误诊为MTB感染，并接受持续无效的抗结核治疗[1]。因此需要更多的临床实验室开展NTM的菌种鉴定及药敏检测，需要临床医生对本病有更多的认识。

3.5 局限性

本研究在浙江大学医学院附属杭州市胸科医院进行，数据无法完全代表杭州地区的总体流行病学，但该院是杭州最大的结核病定点诊治医院，对了解整个杭州地区的NTM感染现状具有一定的代表性；其次，未纳入肺外的NTM感染人群，会导致检出率的低估；此外，每位患者的环境因素未纳入回顾性研究。

综上所述，2013—2021年杭州地区NTM发病率持续上升，感染人群以男性、中老年为主，NTM流行菌种以胞内分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌为主。由于NTM的发病率预计将持续增加，因此有必要进行前瞻性评估，并尽早开展NTM菌种鉴定，这对本病的早期诊治有重要意义。

[1] 中华医学会结核病学分会. 非结核分枝杆菌病诊断与治疗指南(2020年版)[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2020, 43(11): 918–946.

[2] 沙巍, 肖和平. 再议非结核分枝杆菌的危害性[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2018, 41(2): 83–85.

[3] Furuuchi K, Morimoto K, Yoshiyama T, et al. Interrelational changes in the epidemiology and clinical features of nontuberculous mycobacterial pulmonary disease and tuberculosis in a referral hospital in Japan[J]. Respir Med, 2019, 152: 74–80.

[4] 赵雁林. 结核病实验室诊断技术培训教程[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2014: 42–47.

[5] Wassilew N, Hoffmann H, Andrejak C, et al. Pulmonary disease caused by non-tuberculous mycobacteria[J]. Respiration, 2016, 91(5): 386–402.

[6] 全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组, 全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室. 2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J]. 中国防痨杂志, 2012, 34(8): 485–508.

[7] Zhou L, Xu D, Liu H, et al. Trends in the prevalence and antibiotic resistance of non-tuberculous mycobacteria in mainland china, 2000—2019: Systematic review and Meta-analysis[J]. Front Public Health, 2020, 8: 295.

[8] 陈闯, 逯嘉, 杨筠, 等. 中国16省报告非结核分枝杆菌在抗酸染色阳性菌中的分离情况[J]. 预防医学情报杂志, 2017, 33(8): 762–767

[9] Huang J J, Li Y X, Zhao Y, et al. Prevalence of nontuberculous mycobacteria in a tertiary hospital in Beijing, China, January 2013 to December 2018[J]. BMC Microbiol, 2020, 20(1): 158.

[10] 马品云, 谭耀驹, 蔡杏珊, 等. 2013—2015年广州市旧城区各类分枝杆菌流行情况[J]. 中国防痨杂志, 2016, 38(10): 823–826.

[11] 金法祥, 陶学芳, 王华钧, 等. 2017年绍兴地区106株非结核分枝杆菌菌种鉴定结果分析[J]. 中国防痨杂志, 2019, 41(11): 1179–1183.

[12] 陈忠南, 易松林, 胡培磊, 等. 2012—2017年湖南省非结核分枝杆菌感染的特征分析[J]. 中国防痨杂志, 2019, 41(2): 217–221.

[13] 林建, 赵永, 戴志松, 等. 福建省261株非结核分枝杆菌的菌种鉴定分析[J].中国防痨杂志, 2021, 43(6): 590–595.

[14] 洪创跃, 李金莉, 赵广录, 等. 2013—2017年深圳市非结核分枝杆菌流行状况分析[J]. 中国防痨杂志, 2019, 41(5): 529–533.

[15] 罗明, 张汇征, 李桓, 等. 重庆市2016—2017年非结核分枝杆菌流行状况分析[J]. 国际检验医学杂志, 2019, 40(10): 1178–1182.

[16] Wu J, Zhang Y, Li J, et al. Increase in nontuberculous mycobacteria isolated in Shanghai, China: Results from a population-based study[J]. PLoS One, 2014, 9(10): e109736.

[17] 陈涛, 许琳, 杨慧娟, 等. 云南省非结核分枝杆菌流行状况及病原谱分析[J]. 中国热带医学, 2018, 18(9): 7–9.

[18] Winthrop K L, Marras T K, Adjemian J, et al. Incidence and prevalence of nontuberculous mycobacterial lung disease in a large U.S. managed care health plan, 2008—2015[J]. Ann Am Thorac Soc, 2020, 17(2): 178–185.

[19] Hu C, Huang L, Cai M, et al. Characterization of non-tuberculous mycobacterial pulmonary disease in Nanjing district of China[J]. BMC Infect Dis, 2019, 19(1): 764.

[20] Park Y, Kim C Y, Park M S, et al. Age-and sex-related characteristics of the increasing trend of nontuberculous mycobacteria pulmonary disease in a tertiary hospital in South Korea from 2006 to 2016[J]. Korean J Intern Med, 2020, 35(6): 1424–1431.

[21] Zhang Z X, Cherng B P Z, Sng L H, et al. Clinical and microbiological characteristics of non-tuberculous mycobacteria diseases in Singapore with a focus on pulmonary disease, 2012—2016[J]. BMC Infect Dis, 2019, 19(1): 436.

[22] Khosravi A D, Asban B, Hashemzadeh M, et al. Molecular identification, and characterization ofstrains isolated from four tuberculosis regional reference laboratories in Iran during 2016—2018[J]. Infect Drug Resist, 2020, 13: 2171–2180.

[23] Hoefsloot W, van Ingen J, Andrejak C, et al. The geographic diversity of nontuberculous mycobacteriaisolated from pulmonary samples: An NTM-NET collaborative study[J]. Eur Respir J, 2013, 42(6): 1604–1613.

Analysis on the epidemic situation of nontuberculosis mycobacteria pulmonary disease in a general hospital in Hangzhou from 2013 to 2021

HAN Jiaying, QIN Yao, HE Fei

1.Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Affiliated Hangzhou Chest Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, Zhejiang, China; 2.Department of Tuberculosis, Affiliated Hangzhou Chest Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, Zhejiang, China

To analyze the epidemic situation of nontuberculosis mycobacteria (NTM) pulmonary diseases in the tuberculosis designated hospital in Hangzhou city from 2013 to 2021, so as to provide reference for clinical prevention, treatment and epidemiology of NTM disease in Hangzhou city.To collect suspected pulmonary tuberculosis patients admitted to theDepartment ofTuberculosis and Respiratory, Affiliated Hangzhou Chest Hospital, Zhejiang University School of Medicine from 2013 to 2021,who were diagnosed withinfection by acid fast bacilli smears and BACTEC MGIT960, use real-time fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to detect the initial flora identification oftuberculosis complex(MTB) and NTM, use HAIN genotyping identification method and DNA microarray technology to identify the strains identified as NTM, and summarize and analyze the relevant data of patients.From 2013 to 2021, 1257 NTM isolates were isolated from 37520 patients, rising from 0.8% in 2013 to 6.7% in 2021. Among patients, 50.76% were male and 49.24% were female. In the age distribution, the middle-aged and elderly patients aged 60-79 years were the most, accounting for 55.0%. Three NTM strains were detected in 2013,including,and/; In 2021, there were 13 NTM strains, with the first three being,and.From 2013 to 2021, the detection rate of NTM in Hangzhou continued to increase. The majority of infected people were men, middle-aged and elderly people aged 60 to 79 years old. The main strains were,mand.

; Nontuberculous mycobacteria; Strain identification; Disease characteristics; Epidemiology

R18；R52

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.27.002

浙江省中医药科技计划项目（2022ZA127）

覃瑶，电子信箱：418497538@qq.com

（2022–12–26）

（2023–09–03）