银州柴胡根的发育解剖学研究

李 根,韩桂军,李为民,李 斌,周亚福

(1 陕西省西安植物园[陕西省植物研究所],西安 710061;2 陕西省植物资源保护与利用工程技术研究中心,西安 710061)

银州柴胡(BupleurumyinchowenseShan et Y. Li)隶属于伞形科(Umbelliferae)柴胡属,为多年生草本植物。药用部位为干燥根,异名红柴胡、红软柴胡、软柴胡(陕西),卧银花(陕西横山)[1]。其主要有效成分为皂苷和挥发油等,具有和解退热、疏肝解郁、升提中气的功效[2]。

银州柴胡作为柴胡类药材的一种,其名称的出现可追溯至宋代或更早。《本草图经》中提及:“柴胡-银夏出者独胜”。《本草别说》亦称:“柴胡-唯银夏者最良”等[3]。可见在宋代-明代时期,银州一带所产的柴胡普遍为医家所知,并被认为是品质优良的一类。西北传统医药认为,银州柴胡为柴胡中品质最佳品种,且销售量较大,部分地区已将其列入地方标准。主要分布在陕西、宁夏、甘肃和内蒙等省区,是陕甘宁中药柴胡主流品种之一[4]。银州柴胡在陕西省有悠久的药用历史,在陕西北部作红柴胡入药。本课题组前期对柴胡属5种药用植物总皂苷和总黄酮含量进行了测定,发现银州柴胡主要化学成分柴胡皂苷和总黄酮含量均较高,与药典收录的北柴胡和狭叶柴胡主要成分含量类似,表明银州柴胡品质优良,具有很好的开发利用价值[5]。

为进一步合理开发和利用柴胡属其他野生植物资源,很有必要对银州柴胡这一优良种质进行深入系统研究。目前关于银州柴胡的研究主要集中在有效成分的分离提取[2,5-8]、中药鉴定[9-10]以及本草考证[11]等方面。本研究以银州柴胡药用部位根为研究对象,旨在揭示其药用部位的发生发育特点,为柴胡属药用植物的分类鉴定及有效成分积累的研究等提供科学依据。

1 材料和方法

研究材料为伞形科柴胡属银州柴胡(BupleurumyinchowenseShan et Y. Li),采自陕西省咸阳市永寿县(34°41′26.88″ N,108°8′40.92″ E),选取健康生长的银州柴胡根作为试验材料。

采用石蜡切片法对药用植物银州柴胡根进行发育解剖学研究。取银州柴胡根尖、初生结构和次生结构的根,切割至3～5 mm的小段,浸入50%FAA固定液(V∶V,50%酒精∶冰醋酸∶甲醛=90∶5∶5)进行固定48 h[12]。经梯度酒精进行脱水(50%,70%,80%,95%,100%,100%酒精)后,二甲苯透明,石蜡包埋。使用Leica RM 2135旋转切片机切片,厚度为7～12 μm。切片后经番红-固绿染色与铁矾-苏木精染色[12]。Leica全自动荧光生物显微镜(Leica DM 3000 CCD:DFC7000 T)镜检并拍照。

2 结果与分析

2.1 根尖及其组织分化

研究对银州柴胡根尖进行了横切和纵切。结果表明,银州柴胡的根尖从上到下分为:根冠、分生区、伸长区和成熟区(根毛区)4个部分(图1,A)。根冠位于根尖的最先端,纵切面呈帽子状;横切面上根冠细胞总体上形状不规则,均由薄壁细胞组成(图1,B)。根冠最内方的细胞体积小,细胞核大而圆,细胞质浓厚;最外方的细胞体积较大,细胞核部分消失,液泡大而明显(图1,A)。分生区紧邻根冠,位于根冠和伸长区之间即顶端分生组织,顶端分生组织由原分生组织(图1,C)及其衍生的初生分生组织组成(图1,D)。

A. 根尖纵切,示根冠、分生区、伸长区和成熟区;B. 根冠横切;C. 原生分生组织;D. 原表皮外方的根冠组织、原表皮、皮层原以及中柱原;E. 表皮、皮层和维管柱以及原生韧皮部筛管;F. 荧光显微照片,表皮、皮层和维管柱以及原生韧皮部筛管;G. 根初生结构,由表皮、皮层和维管柱组成;H. 荧光显微照片,示内皮层凯氏带以及表皮细胞明显的径向壁加厚。Co.皮层;CC.木栓形成层;CL.木栓层;CS.凯氏带;EN.内皮层;EP.表皮;IC.皮层原;IS.中柱原;PE.中柱鞘;PP.原表皮;PPS.原生韧皮部筛管;PRP.原生韧皮部;PRX.原生木质部;RC.根冠;RWT.径向壁加厚;S.中柱;SC.分泌道;SXF.次生木质部纤维;VS.维管形成层。

原分生组织细胞由未分化的细胞组成,其细胞体积小、等径、排列紧密、细胞壁薄而细胞质浓厚、细胞核大而明显且液泡极小,具有典型的分生组织的特点。初生分生组织位于原分生组织前后方,由原分生组织细胞的衍生细胞组成,其组织细胞已开始分化,细胞体积增大且呈长方形,细胞质逐渐变薄,液泡体积增大。

在纵切片上,银州柴胡根初生分生组织由根冠原、表皮原、皮层原和中柱原四部分组成(图1,A)。根冠原位于原分生组织上方,是根冠最内方的细胞群,其分化产生根冠(图1,B)。从横切面上,表皮原位于根初生分生组织的最外方,由一层排列紧密且整齐的细胞组成,细胞体积小而呈矩形,细胞质浓厚(图1,D)。皮层原位于表皮原的下方,5～7层类圆形或矩形的细胞组成(图1,D)。中柱原位于根的中央,细胞体积小,等径或呈圆形、类圆形,细胞质浓厚且细胞核大而明显(图1,D)。

2.2 根初生生长与初生结构

银州柴胡根的初生结构是通过初生生长过程中初生分生组织的衍生细胞进一步分化成熟而来。在此过程中,原表皮组织形成根的表皮,皮层原或基本分生组织形成根的皮层,中柱原形成根的维管柱。表皮、皮层和维管柱组成银州柴胡根的初生结构。

在初生结构分化过程中,皮层出现相对较早,其次为表皮层和中柱的出现。早期形成的表皮细胞,等径或类圆形,排列紧密,随着表皮细胞的成熟,其细胞呈长方柱形。相对于表皮和中柱,皮层细胞体积大,细胞质薄,液泡化明显,排列相对疏松,紧贴表皮的皮层细胞和内皮层细胞体积较小(图1,E)。在维管柱最外方,由1圈中柱鞘细胞组成。在维管柱中,韧皮部首先分化,表现为对称分布的2个区域,该区域细胞体积小且排列紧密,细胞质浓厚且细胞核明显,在相对位置韧皮部外方分化出最早的原生韧皮部筛管,在荧光显微镜下表现为2个细胞壁较厚的菱形细胞(图1,F),随之形成后生韧皮部。

在2个韧皮部之间的位置形成木质部,位于外方原生木质部的导管最先形成,内方的后生木质部导管依次形成,木质部脊为2束(图1,G、H)。本研究采用荧光显微镜对银州柴胡根的初生结构进行了观察,可明显观察到内皮层细胞径向壁加厚的凯氏带结构(图1,H);同时,银州柴胡根初生结构的表皮细胞上也可观察到加厚的径向壁荧光(图1,H)。

2.3 根次生生长与次生结构

在银州柴胡根的初生结构中,维管柱主要由初生木质部、初生韧皮部以及外围的中柱鞘细胞层组成,原形成层位于初生木质部和初生韧皮部之间。随着发育的进行,位于银州柴胡根初生木质部和初生韧皮部之间的原形成层恢复分裂能力形成维管形成层(图2,A)。维管形成层不断的向内形成次生木质部,向外形成次生韧皮部,随之原生木质部上方对应的中柱鞘细胞进行分裂并向两边扩展,形成连续的维管形成层。

A. 早期维管形成层;B. 维管形成层环;C. 皮层、内皮层、木栓层、栓内层的分泌道以及维管形成层;D. 荧光显微镜下表皮细胞的径向壁加厚、皮层、内皮层、木栓层以及栓内层的分泌道。

在早期,维管形成层产生次生木质部的速度大于形成次生韧皮部,使得维管形成层环不断的向外推进,最后在次生木质部和次生韧皮部之间形成1个闭合的维管形成层环(图2,B)。

次生维管组织的产生使得根初生结构如表皮、皮层以及中柱鞘组织不断地向外推进(图2,C)。当维管形成层活动到一定的时期,此时根内皮层内方的中柱鞘组织恢复分裂能力形成木栓形成层,木栓形成层向外形成木栓层,向内形成栓内层(图2,C、D)。

此时,木栓层外方的表皮、皮层等尚未脱落,可明显的观察到根表皮细胞径向壁加厚的荧光以及内皮层的凯氏带加厚(图2,D)。随着栓内层层数的增加,在栓内层中3～4个细胞之间发生细胞壁分离,最初形成3～4个分泌细胞围绕的细胞腔隙或分泌腔隙(图2,C、D),随着发育的进行,分泌细胞的数量不断增加。

多年生银州柴胡根周皮由8～15层扁平的细胞组成,最外方的木栓层细胞细胞壁厚,原生质消失;木栓形成层细胞体积较小,细胞质浓厚;内方的栓内层细胞体积较大(图3,A-C)。随着维管形成层和木栓形成层的不断活动,根的直径不断增大,表皮和皮层完全脱落(图3,A、B)。在横切面上,成熟的根由外到内由周皮(木栓层、木栓形成层和栓内层)、次生韧皮部、维管形成层、次生木质部以及初生木质部组成(图3,A)。在发育早期,根次生韧皮部较宽广,占根横切面面积约70%。随着根的发育,使得根不断的增粗生长,次生韧皮部和次生木质部面积不断增加。多年生银州柴胡根的次生木质部相对面积不断增加,且在次生木质部导管周围分布有细胞壁加厚的木质部纤维群(图3,B,D)。

在银州柴胡根次生韧皮部,还观察到由4～20个分泌细胞围绕的细胞腔隙(图3,E)。研究发现,在距离维管形成层5～8个细胞位置的次生韧皮部,形成由4个分泌细胞相互分离而形产生的小细胞腔隙;其中次生韧皮部外围的细胞腔隙直径较大,但在木质部中未观察到由分泌细胞组成的细胞腔隙。随着根直径的增加,次生韧皮部和中柱鞘的分泌腔隙数量和分泌细胞的数量逐渐增加。在多年生根的中柱鞘位置,可观察到由3～16个分泌细胞组成的分泌腔隙(图3,F～G),在根横切面上排列为一圈。

在纵切面上,中柱鞘(图3,H)和次生韧皮部(图3,I)位置上的分泌腔隙呈引长的管状结构,特别是中柱鞘位置的分泌腔隙表现为分支的管状结构(图3,H)。

3 讨 论

中药柴胡为中国大宗中药材,关于柴胡属药用植物根的结构发育备受关注。本研究结果表明,多年生银州柴胡根的结构主要由周皮、次生韧皮部和次生木质部组成,这与北柴胡和狭叶柴胡根的一般特点[13-14]一致。在银州柴胡发育早期的根中尚未观察到木纤维,但在多年生根次生木质部发现有大量的木纤维群分布,这与北柴胡根的特点[14]类似,但多年生狭叶柴胡根次生木质部纤维少或无[15],明显区别于银州柴胡。谭玲玲等[13]和郑丽等[14]对北柴胡和狭叶柴胡根的发育进行了研究,表明北柴胡初生木质部为二元型,但狭叶柴胡根初生木质部为二元型,少数为三原型。本研究结果显示,银州柴胡根初生木质部为二元型,亦有三元型,和狭叶柴胡[14]相吻合,也和李广民和钱丽霞的报道[16]一致。

此外,本研究采用荧光显微镜技术对银州柴胡根初生结构进行观察研究,结果显示在横切面上,当根初生结构完全分化,除了在根的内皮层细胞可观察到径向壁加厚的凯氏带外,在根表皮细胞的径向壁亦观察到加厚的细胞壁结构。虽然本研究尚未证实表皮细胞横向壁是否具有加厚的细胞壁结构,但从其结构特点来看,推测为一种类似凯氏带的结构。研究表明,在很多高等植物根内皮层以外的部位均发现凯氏带或类似凯氏带的结构,如罂粟科植物白屈菜根的外皮层、天竺葵茎中木栓细胞中以及豌豆黄化苗茎中以及松科植物针叶内皮层细胞壁[17]。在我国,银州柴胡主要分布在陕西北部、甘肃的榆中和静宁、宁夏的海源及内蒙古等西北干旱的区域,生长于干燥山坡及多沙地带瘠薄的土壤中[1]。银州柴胡根表皮细胞径向壁加厚,其作用可能类似植物根内皮层凯氏带,并作为根吸收过程的第一道选择屏障,起着防止水分通过非共质体外渗、抵御干旱及养分选择性吸收等重要的角色[17],其具体结构特点还需要从超微结构水平去进一步深入研究。

蔡少青等[18]报道,在北柴胡和狭叶柴胡根的皮层和韧皮部中分布有油室。潘胜利等[19]报道,在柴胡属植物中柱鞘组织分布有分泌道,而在韧皮部则分布为油室。在植物学上,分泌道是一类引长的管状结构,而油室则为一种储存油类物质的细胞腔隙或分泌腔[20]。本研究对银州柴胡根进行了纵切,结果显示根中柱鞘和次生韧皮部的分泌腔隙或细胞腔隙均为引长的分泌道,且银州柴胡根中柱鞘分泌道为一种分支的管状结构。从分泌道形成的方式来看,银州柴胡中柱鞘分泌道和次生韧皮部分泌道均为分泌细胞的相互分离而形成,是一种裂生型分泌道,和北柴胡分泌道形成方式[13,20]一致。

Metcalfe和Chalk[21]指出,分泌道在伞形科普遍存在,是伞形科植物的典型结构特点。李广民和钱丽霞[16]对西北产6种药用柴胡营养器官的比较解剖学进行了研究,表明分泌道分布于根的皮层和韧皮部中。本研究结果显示,在根初生结构的皮层中尚未观察到分泌道的分布,分泌道形成于木栓形成层和维管形成层的活动而产生的栓内层和次生韧皮部而非皮层中,是典型的次生分泌结构,这和北柴胡分泌道的研究结果[13,20]相吻合。由于银州柴胡根分泌道的形成与中柱鞘和维管形成层衍生细胞的活动密切相关,故称之为中柱鞘分泌道和次生韧皮部分泌道。从发育的角度,当银州柴胡根的周皮形成初期,在栓内层中即形成了中柱鞘分泌道,此时次生韧皮部分泌道尚未观察到,即相对于次生韧皮部分泌道的形成,中柱鞘分泌道出现较早。

银州柴胡根周皮的栓内层和次生韧皮部均分布有分泌道,与北柴胡和红柴胡[13-14]一致,但在紫花大叶柴胡根次生韧皮部尚未观察到分泌道[22]。从分泌道和分泌细胞的数量上来看,相同大小银州柴胡根中次生韧皮部的分泌道和分泌细胞数量均大于北柴胡而小于狭叶柴胡[15]。由此可见,银州柴胡根中柱鞘及次生韧皮部分泌道与柴胡属其他植物相应位置的分泌道在形态上相似,但分泌道的数量及大小等可作为柴胡属植物重要的分类鉴定依据。