响应面法优化甜茶苷的超声提取工艺

刘 英,郭洋洋,徐永莉,张贞发,韦 莹,冯世鑫,闫志刚*

(1.广西民族师范学院,广西 崇左 532200;2.广西壮族自治区药用植物园,广西 南宁 530023)

甜茶(RubussuavissimusS. Lee)为蔷薇科多年生灌木,是广西特有的天然甜味植物,具有“茶、糖、药”3种身份[1-2]。甜茶中富含甜茶苷、茶多酚、黄酮等化学成分及多种微量元素[3],具有降血糖、降血脂、降血压、抗过敏、抗氧化、防癌、抗癌、护肝等药理作用[4],同时具有生津止渴、润肺祛痰、清热降火等多重功效。甜茶苷是甜茶中特有的有效成分,具有降血糖[5-6]、降血压、治疗胃酸过多以及促进新陈代谢等作用。作者在此以甜茶苷提取率为评价指标,在单因素实验的基础上,采用响应面法[7-8]对甜茶苷的超声提取工艺进行优化,以期为甜茶苷的进一步开发利用提供帮助。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

甜茶叶,采自广西荔浦县,烘干粉碎后备用。

甜茶苷对照品,成都曼思特生物科技有限公司;甲醇(色谱纯),西陇科学股份有限公司;无水乙醇(分析纯),成都科隆化学品有限公司。

Agilent 1260 Infinity型高效液相色谱仪,美国安捷伦公司;FW177型中草药粉碎机,天津仪器有限公司;EL204型电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 标准曲线的绘制

准确称取0.010 0 g甜茶苷对照品,用少量甲醇溶解,转移到10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得到1 mg·mL-1甜茶苷标准溶液。准确吸取甜茶苷标准溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL分别置于10 mL容量瓶中,并用甲醇定容至刻度,摇匀,得到质量浓度分别为0.01 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1的甜茶苷溶液,用0.45 μm微孔滤膜过滤,待用。分别吸取各浓度甜茶苷溶液20 μL,在210 nm波长处进行高效液相色谱分析,记录峰面积(n=5)。以峰面积(y)为纵坐标、甜茶苷溶液浓度(c,mg·mL-1)为横坐标,绘制标准曲线,拟合得到甜茶苷线性回归方程为:y=4775.7c+75.1(R=0.9998)。表明甜茶苷浓度在0.01～0.4 mg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

1.3 甜茶苷的提取

精准称量1.000 0 g甜茶叶粉末,按一定料液比加入一定体积分数的乙醇,在一定温度下超声提取一定时间,得到甜茶苷提取液。按1.2方法进行高效液相色谱分析,记录峰面积,依据标准曲线方程计算甜茶苷浓度,进而计算甜茶苷提取率。

1.4 提取工艺的优化

以甜茶苷提取率为评价指标,采用单因素实验分别考察乙醇体积分数(20%、40%、60%、80%、100%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50,g∶mL,下同)、超声温度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)和超声时间(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)对甜茶苷提取率的影响;在单因素实验的基础上,以乙醇体积分数、料液比、超声温度、超声时间为考察因素,以甜茶苷提取率为评价指标,通过Box-Behnken[9-12]设计4因素3水平响应面实验,优化甜茶苷超声提取工艺。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇体积分数对甜茶苷提取率的影响(图1)

图1 乙醇体积分数对甜茶苷提取率的影响

由图1可知,随着乙醇体积分数的增加,甜茶苷提取率先升高后降低;在乙醇体积分数为40%时,提取率达到最高。这是因为,随着乙醇体积分数的增加,甜茶苷溶出量逐渐增加,提取率相应升高;但乙醇体积分数超过40%后,除了溶出甜茶苷外,能溶于乙醇的杂质也逐渐增多,单位体积内的甜茶苷提取率反而降低。因此,乙醇体积分数以40%较为适宜。

2.1.2 料液比对甜茶苷提取率的影响(图2)

图2 料液比对甜茶苷提取率的影响

由图2可知,随着料液比的减小,即提取溶剂用量的增加,甜茶苷提取率先升高后降低;在料液比为1∶30时,提取率达到最高。这是因为,甜茶苷的提取是一个浓度差为推动力的过程,刚开始时浓度差随料液比的减小而增大,提取率相应升高;当料液比为1∶30时,甜茶苷从甜茶叶细胞中的溶出速率达到最大,提取率达到最高;继续增加溶剂用量,一方面会稀释甜茶苷,另一方面会有更多的色素及其它杂质溶出,导致提取率下降。因此,料液比以1∶30较为适宜。

2.1.3 超声温度对甜茶苷提取率的影响(图3)

由图3可知,随着超声温度的升高,甜茶苷提取率先升高后降低;在超声温度为60 ℃时,提取率达到最高。这是因为,超声波能够破碎植物细胞,升高超声温度,甜茶苷从甜茶叶中的溶出速率相应加快,提取率升高;当超声温度超过60 ℃时,杂质溶出量增加,导致提取率下降。因此,超声温度以60 ℃较为适宜。

2.1.4 超声时间对甜茶苷提取率的影响(图4)

由图4可知,随着超声时间的延长,甜茶苷提取率先升高后降低;在超声时间为30 min时,提取率达到最高。这是因为,甜茶苷的提取是一个传质过程,30 min前甜茶叶中的甜茶苷溶出不完全,延长超声时间,传质量增加,提取率显著升高;30 min后,甜茶苷溶出速率降低,溶剂中的甜茶苷浓度增加不明显,最终稳定而达到动态平衡,同时延长超声时间,也可能溶出更多的杂质,导致甜茶苷提取率下降。因此,超声时间以30 min较为适宜。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 实验设计与回归模型

在单因素实验的基础上,以甜茶苷提取率为评价指标,分别以40%、1∶30、60 ℃、30 min作为响应面实验中乙醇体积分数、料液比、超声温度、超声时间的中心值,通过Box-Behnken设计4因素3水平响应面实验,结果见表1。

表1 响应面实验结果

通过Design-Expert 8.0.6软件对表1数据进行线性回归分析与拟合[13],得到甜茶苷提取率数学模型:Y=-63.06+0.59A+0.98B+1.12C+0.49D+0.00145AB-0.0038AC-0.0026AD+0.00295BC+0.00075BD-0.0026CD-0.004383A2-0.021B2-0.008008C2-0.004258D2。可以看出,各因素对甜茶苷提取率的影响顺序为:超声温度(C)>料液比(B)>乙醇体积分数(A)>超声时间(D),乙醇体积分数和超声温度的交互作用(AC)对甜茶苷提取率的影响最大。

2.2.2 方差分析

对拟合的数学模型进行方差分析,结果见表2。

表2 方差分析

由表2可知,该模型极显著(P<0.01),模型的R2=0.9732,自变量与响应值关系显著;失拟项P=0.3249>0.1,表明失拟项在α=0.1水平上不显著,此模型与实际值的拟合度较高;一次项中,乙醇体积分数(A)、料液比(B)、超声温度(C)和超声时间(D)对甜茶苷提取率的影响极显著(P<0.01);交互项中,乙醇体积分数与超声温度的交互作用(AC)、乙醇体积分数与超声时间的交互作用(AD)对甜茶苷提取率的影响极显著(P<0.01),料液比与超声温度的交互作用(BC)对甜茶苷提取率的影响显著(P<0.05),乙醇体积分数与料液比的交互作用(AB)对甜茶苷提取率的影响不显著(P>0.05);二次项中,A2、B2、C2、D2对甜茶苷提取率的影响极显著(P<0.01)。

2.2.3 响应面分析

使用Design-Expert 8.0.6软件对实验数据进行处理[14-15],得到各因素交互作用对甜茶苷提取率影响的响应面图,结果如图5所示。

图5 各因素交互作用对甜茶苷提取率影响的响应面图

图5a、e的响应曲面坡度较平缓,表明乙醇体积分数与料液比的交互作用、料液比与超声时间的交互作用对甜茶苷提取率的影响不显著。图5b、c、f的响应曲面坡度较大,表明乙醇体积分数与超声温度的交互作用、乙醇体积分数与超声时间的交互作用、超声温度与超声时间的交互作用对甜茶苷提取率的影响极显著。图5d的响应曲面坡度适中,表明料液比与超声温度的交互作用对甜茶苷提取率的影响显著。使用Design-Expert 8.0.6软件对模型进行分析与处理,得到甜茶苷最优提取工艺条件为:乙醇体积分数35.93%、料液比1∶29.41、超声温度61.64 ℃、超声时间30.68 min,在此条件下,甜茶苷提取率达到3.88%。为提高实验的可操作性,将最优条件修正为:乙醇体积分数36%、料液比1∶30、超声温度62 ℃、超声时间30 min。

2.3 验证实验

在上述最优条件下,进行3次验证实验,其HPLC图谱如图6所示。

图6 对照品溶液(a、b)和供试品溶液(c、d、e)的HPLC图谱

由图6可知,3次验证实验得到的甜茶苷提取率分别为3.62%、3.88%、3.36%,平均值为3.62%,与理论值(3.88%)较为接近。表明优化的提取工艺较为可靠。

3 结论

在单因素实验的基础上,采用响应面法优化甜茶苷的超声提取工艺。得到最优提取工艺为:乙醇体积分数36%、料液比1∶30(g∶mL)、超声温度62 ℃、超声时间30 min,在此条件下,甜茶苷平均提取率为3.62%,与预测值(3.88%)仅相差0.26%。该优化提取工艺操作方便,结果可靠,为甜茶苷的进一步开发利用提供了依据。