藤茶复合汤汁抗大鼠血栓功效研究

2023-10-17范志平刘庆庆高健强

湖北农业科学 2023年9期

谢勇，范志平，施伽，刘庆庆，高健强

（1.铜仁学院，a材料与化学工程学院；b.梵净山野生动植物资源保护与利用研究中心，贵州铜仁 554300；2.四川省宜宾市食品药品检验检测中心，四川宜宾 644000）

血栓是动脉或静脉系统中的血液凝块，多由高血压、血脂异常、糖尿病、不健康生活方式及代谢性疾病等因素引起，是动脉粥样硬化的基础［1］。血栓易导致急/慢性脑缺血形成（脑栓塞）和血管狭窄或闭塞，从而引发心脏病、中风等疾病［2］，也是癌症［3］、生物假体植入［4］等常见并发症。血栓形成的主要诱因为瘀血、血管壁的变化和血液成分的变化［5］。内皮细胞损伤可以导致微血管栓塞及高血压的发生［6］，血小板活化与凝血联级反应是动脉粥样硬化狭窄的主要因素，易形成动脉粥样硬化血栓进而引起外周动脉疾病［7］。研究发现，年龄是血栓形成的最主要因素，随着年龄的增加，血管脆弱性逐渐增强，凝血因子水平增加，静脉瓣膜功能受损，降低与血管壁相关天然抗凝血剂的功效［5］。虽然抗血栓药物（如氯吡格雷、噻氯匹定、普拉格雷等）具有较好的抗血栓效果，但是副作用也较明显，如损伤消化道功能，导致消化道出血等，而且增加了消费者的医疗负担［8］。因此，基于药食两用植物活性成分，开发抗血栓功能饮料，对于血栓疾病的预防，兼具更高的安全性和低成本效益。

藤茶（Ampelopsis grossedentata），也称显齿蛇葡萄，属于药食两用野生植物，因其具有多种生理功效而备受关注。其中，二氢杨梅素（Dihydromyricetin，DHM）是藤茶中关键活性成分，干重含量高达30%［9］。研究表明，藤茶具有抑制α-葡萄糖苷酶和抗高血糖活性［10］、改善代谢综合征［11］、抗氧化活性［12］、抑菌［13］等多种功效。目前，藤茶产品主要以茶替代品为主，产品种类较少。人们对食品中非营养生物活性化合物作为“寿命营养素”在减少非传染性疾病风险方面有着新的兴趣［14］。功能性饮料，作为平衡饮食的部分及营养与生物活性化合物的优良递送载体，可提高生命体的健康状况［14，15］。已有研究发现藤茶黄酮类化合物具有一定的抗血栓功效［16］，且富含多酚和黄酮的饮料也有一定的抗血小板凝集活性［17］。

因此，本试验以藤茶、丹参、绞股蓝及金银花4种药食两用植物为原料制备藤茶复合汤汁，并在大鼠体内评估其抗血栓功效，为藤茶功能性饮料的开发提供参考及消费者保持或改善健康状况提供更多选择。

1 材料与方法

1.1 材料

藤茶：贵州省铜仁学院藤茶种植基地（铜仁市江口县德旺品种，发芽35 d 左右采摘）；金银花、绞股蓝及丹参：市售。

1.2 试剂

DHM（纯度>98%，上海原叶生物技术有限公司，CAS：27200-12-0）；戊巴比妥钠（广州莱润实验仪器有限公司）；多聚甲醛（生工生物工程（上海）股份有限公司）；0.9%氯化钠注射液（河北天成药业有限公司）；SD 大鼠（重庆腾鑫生物技术有限公司）；HE 染色试剂盒、生物素标记兔抗二抗及一抗兔抗大鼠血栓素1（Thromboxane A synthase 1，TBXAS1）多克隆抗体，购于Cell-Signaling 公司。

图1 不同处理大鼠血栓的长度

图2 不同处理大鼠血栓样品的HE 染色

1.3 仪器与设备

SYNERGYH1MG 型酶标仪，美国Genentech 公司；JT-12S 型自动组织脱水机，武汉俊杰电子有限公司；NAI-ZFCDY-2Z 型脂肪测定仪，上海那艾精密仪器有限公司；SRH-S 型均质机，上海世赫机电设备有限公司。BMJ-A 型组织包埋机，常州中威电子仪器厂；Pannoramic 250 型数字切片扫描仪，匈牙利3DHISTECH（Hungary）公司；RS36 型全自动染色机，常州派斯杰医疗设备有限公司；LC-20A 型高效液相色谱仪（HPLC），日本岛津公司。

1.4 样品制备

称取一定量的干燥藤茶、绞股蓝、金银花及丹参样品，均按照1∶100 比例加入蒸馏水，于70 ℃水浴浸提40 min，过滤后收集滤液，备用；按照谢勇等［18］的方法制备藤茶复合汤汁。即，藤茶∶绞股蓝∶金银花∶丹参=300∶200∶250∶100（V∶V∶V∶V），加蒸馏水至总体积1 000 mL，制得藤茶复合汤汁。将850 mL 藤茶提取液稀释至1 000 mL，制得藤茶汤汁。另外，精确称取2.70 g DHM，加入少量70 ℃去离子水，溶解后定容至1 000 mL，制得DHM 溶液。样品中总黄酮含量采用比色法（λ=326 nm）测定，DHM 含量测定参照Chien 等［11］的方法。

1.5 大鼠下腔静脉血栓模型的构建

1.5.1 动物饲养及建模 SPF 级SD 大鼠，体重（327.4±41.7）g，雄性，共40 只，分为A 组（正常组）、B 组（模型组）、C 组（DHM 组）、D 组（藤茶汤汁组）和E 组（藤茶复合汤汁），每组8 只。大鼠12 h∶12 h 昼夜交替饲养，自由饮水及进食，室内温度控制在25 ℃左右，湿度60%左右，适应性饲养1 周后建模。

B、C、D、E 组血栓模型的建立：术前12 h 禁食，不限饮水。参照Cho 等［19］的方法建立动物模型。腹腔注射2%戊巴比妥钠生理盐水进行麻醉，经大鼠腹部正中切口进腹，将小肠牵向视野左侧，充分显露下腔静脉，打开后腹膜，确认左肾静脉下方2 mm 处的下腔静脉结扎点，游离下腔静脉，用5-0 爱惜康缝线逐一显露和结扎左肾静脉以下的下腔静脉分支至髂静脉水平。结扎下腔静脉分支后，在结扎点穿过5-0 爱惜康缝线，另取1 根4-0 爱惜康缝线与下腔静脉主干并排，5-0 缝线方结打结后，抽出并排的4-0缝线，完成下腔静脉“狭窄”模型，主要操作结束后，逐层关腹。A 组：与造模组进行同样的麻醉处理，开腹、显露下腔静脉结扎点后用5-0 爱惜康缝线结扎，确认无活动出血，逐层关腹。所有大鼠术后自由饮水，正常饲养。

1.5.2 模型的确定模型建立72 h 后，各组随机取2 只，利用CO2处死后沿原腹部切口作梭形切口进腹，解剖左肾静脉以下下腔静脉至左右髂总静脉汇合处，分离下腔静脉，切取左肾静脉以下下腔静脉及其内部的血栓，4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋、常规切片后行H&E 染色及ED-1 免疫组化染色，确定建模是否成功。

1.6 干预处理

建模成功后，C、D、E 组分别灌胃DHM 溶液、藤茶汤汁和藤茶复合汤汁，剂量参照文献［20］并适当调整，即40 mL/kg，1 次/d 连续灌胃7 d。A、B 组灌胃等量生理盐水。

1.7 指标测定

1.7.1 取材及样品处理末次给药结束后1 h，按300 mg/kg 剂量腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，打开腹腔，B 组中随机处死2 只大鼠，将取出的血栓用PBS 缓冲液清洗、4%多聚甲醛固定（24 h 以上），然后将组织浸泡在75%、85%、95%、100%乙醇溶液中各10 min，将脱水后的组织分别浸泡在1/2 二甲苯、二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中10 min 随后进行透蜡和包埋、切片（2~4 μm）、烤片（70 ℃，30 min）、脱蜡，并将脱蜡后的石蜡切片浸泡于100%乙醇溶液Ⅰ、100%乙醇溶液Ⅱ、95%乙醇溶液Ⅰ、95%乙醇溶液Ⅱ、85%乙醇溶液、75%乙醇溶液中各5 min。

1.7.2 血栓抑制率的测定按照模型鉴定方法取出血栓样品后，用滤纸吸干残留血液，称量质量（m）及长度（L）。然后将血栓样品置于60 ℃烘箱中干燥24 h。再按照式（1）计算各组血栓抑制率（antithrombotic rate，ATR）。

式中，m0为模型组血栓质量（mg）；m1为试验组血栓质量（mg）。

1.7.3 HE 染色及血栓面积占静脉管腔面积百分比的测定 HE 染色后用95%乙醇溶液脱水处理3 次，2 min/次，脱水后用二甲苯透明2 次，每次5 min，中性树胶封片后进行镜检。从结扎点依次向远端间隔3 mm 连续切片5 张，40 倍视野下观察并用软件（The 3DHISTECH software）计算血栓面积占下腔静脉管腔面积的百分比。

1.7.4 血栓溶解率的测定常规HE 染色，从结扎点依次向远端间隔3 mm 连续切片5 张，40 倍和100倍视野下观察并用上述软件计算血栓溶解率（Thrombosis ablation rate，TAR）。

式中，S0为管腔面积（mm2）；S1为血管腔内血栓面积（mm2）。

1.7.5 免疫组化分析血栓标本制片方法与HE染色相同，经脱蜡和复水后用去离子水清洗3次，2 min/次，再用3% H2O2溶液处理15 min，PBS 溶液漂洗3 次，2 min/次；将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92~98 ℃并持续10~15 min；取出样品后室温冷却10~20 min，再用PBS 溶液清洗2 次，2 min/次；结束后擦去水分，滴加5% PBS 溶液稀释的山羊血清，37 ℃孵育5 min后进行封闭；倾去血清后滴加稀释一抗工作液，37 ℃孵育1.5 h，PBS 溶液清洗3 次，5 min/次；滴加一抗增强剂，室温孵育20 min，PBS 溶液清洗2 次，5 min/次；滴加二抗，室温孵育30 min，PBS 溶液清洗3 次，5 min/次；经DAB 显色（室温10 min）、核复染、脱水、透明、固封后，镜下观察，并利用Image J 软件（version 1.8.0）进行灰度分析，计算血栓素的相对表达量。

1.8 数据处理

采用SPSS 19 软件和Origin 86 软件分别进行数据统计和作图分析，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 样品总黄酮及DHM 含量

各样品中总黄酮及DHM 含量如表1 所示。根据藤茶提取液的总黄酮含量，计算出藤茶总黄酮干基含量在32%左右，DHM占总黄酮的69%左右，说明藤茶中黄酮以DHM 为主，与之前研究结果接近［9，18］。与Ye 等［12］的研究相比，黄酮含量少2.8%，DHM 含量约高5%。与藤茶汤汁比，DHM 溶液总黄酮含量无显著差异，但藤茶复合汤汁显著（P<0.05）降低，而藤茶提取液显著增加。DHM 溶液中除了DHM 含量显著高于藤茶汤汁组外，其他组之间DHM 变化规律与总黄酮相似。按藤茶提取液计算，藤茶复合汤汁中总黄酮含量为0.95 mg/mL，该结果显著低于实际测均值1.43 mg/mL。藤茶复合汤汁中黄酮含量的增加，可能是绞股蓝、丹参及金银花含有一定量的黄酮类化合物导致，如绞股蓝中的懈皮素（Quercetin）、芸香苷（Rutin）及商陆黄素（Ombuim）等［21］。

表1 样品总黄酮及DHM 含量

2.2 血栓重量及抑制率

藤茶汤汁对大鼠血栓形成的影响如图1 和表2所示。正常组（A）未形成血栓，而模型组（B）的血栓长度及湿重均显著高于试验组（P<0.05）。藤茶复合汤汁组（E）的湿重抑制率和干重抑制率分别达54.4%和64.5%，均高于DHM 组（C）和藤茶汤汁组（D）。与叶勇等［16］研究相比，模型组血栓质量明显增加，DHM 干重抑制率低，这可能主要是由建模及药物干预时间、药物剂量差异导致的。图1 也进一步说明藤茶复合汤汁具有更好的抗血栓效果。另外，金银花、丹参及绞股蓝中也存在多种活性成分，如绿原酸和异绿原酸［22］、丹酚酸（Salvianolic acid）［23］及绞股蓝皂苷（Gypenoside）［24］。这些成分可能通过协同作用增强了藤茶复合汤汁的抗血栓功效，说明藤茶复合汤汁更有利于血栓的抑制作用，可能得益于藤茶中的黄酮与其他植物中的有机酸、皂苷及其他活性成分的协同作用。

表2 不同处理对大鼠血栓质量、长度及抑制率的影响

2.3 HE 染色

各组静脉血管离体组织HE 染色结果如图2 所示。正常组（A 组）的细胞形态及结构完整，排列连续、规整，未见变性或其他异常，也未见血栓形成。而模型组（B 组）的细胞结构则受到严重损伤，出现核固缩和溶解现象。经不同干预处理后，细胞损伤程度有所减轻，结构完整的细胞增加，核固缩现象程度减轻，且相比于藤茶汤汁组（D 组）和DHM 组（C组），藤茶复合汤汁组（E 组）细胞的病变进一步减轻，表现出更佳的修复效果。藤茶复合汤汁组对血栓形成的抑制效果更佳明显，可能得益于复合汤汁中多种功效成分的协同作用。

2.4 血栓面积及溶解率

血栓面积占静脉血管腔面积的百分比及血栓溶解率如图3 所示。由于正常组（A 组）没有血栓形成，其血栓面积占静脉血管腔面积的百分比设为0。模型组（B 组）血栓面积最高，达到61.5%。经DHM（C 组）、藤茶汤汁（D 组）及藤茶复合汤汁（E 组）干预后，血栓面积有所降低，且藤茶复合汤汁组血栓面积最低，减少到28.9%。E 组血栓溶解率达到53.0%，比D 组和E 组分别增加10.1 个百分点和14.2 个百分点，进一步说明藤茶复合汤汁具有更好的抗血栓作用。

图3 不同处理大鼠血栓的溶解率（A）及血栓面积占血管腔面积百分比（B）

2.5 TBXAS1 免疫组化染色

图4 不同处理大鼠血栓的血管腔免疫组化分析

各组大鼠血栓样本TBXAS1 免疫组化染色结果如图4 所示。由图4 可知，正常组（A 组）细胞结构完整，仅有极少量细胞质黄染。而模型组（B 组）中大量细胞质黄染而呈棕黄色，细胞结构紊乱，且TBXAS1 阳性细胞数量明显增加。相比模型组，干预组（C、D、E 组）的TBXAS1 细胞阳性数均有所降低，其中，藤茶复合汤汁组（图4 E）最低。

同时，各组TBXAS1 的表达量（图5）也进一步说明DHM、藤茶汤汁及藤茶复合汤汁均能抑制血栓素的表达，进而抑制血栓的形成，且藤茶复合汤汁具有相对更好的抗血栓作用。

图5 不同处理大鼠TBXAS1 相对表达量

3 讨论

随着人们生活方式的改变，心血管疾病流行率逐年递增，严重影响了人们的身心健康［25］。动脉粥样硬化是导致心血管疾病的重要风险因素［26］。研究表明，血栓的形成与动脉粥样硬化存在诸多关联［2］。因而，预防血栓形成是降低心血管疾病的重要有效途径。血栓成分主要包括血小板、红细胞及纤维蛋白，其中，血小板在血栓形成过程中起到关键作用［27］。而血小板活化因子、凝血酶及血栓素是调节凝血功能的关键因子［2，28］，其中血栓素通过促进血小板的聚集而对心血管疾病的产生具有重要影响，因而受到广泛关注［29，30］。而血栓素的表达与机体氧化应激和炎症水平等因素紧密相关［31，32］。抗血栓药物或干预物可通过调节机体氧化应激与炎症水平，进而调节血小板功能实现抗血栓功效，其中血栓素A2 就是重要的抑制靶点［32，33］。本研究中DHM、藤茶汤汁及藤茶复合汤汁干预血栓大鼠后，血栓质量、长度、血栓抑制率均显著下降，且藤茶复合汤汁效果最为明显；HE 染色显示，相比模型组，干预组血栓面积占血管腔面积百分比显著降低，其中藤茶复合汤汁效果更佳，且血栓溶解率也最高，说明DHM能抑制血栓的形成，也进一步说明藤茶复合汤汁的抗血栓效果更好；免疫组化分析也表明，干预后大鼠TBXAS1 相对表达量均显著低于模型组，且藤茶复合汤汁TBXAS1 的相对表达量最低，说明除了DHM外，藤茶复合汤汁中其他成分也能通过抑制TBXAS1 的表达进而抑制血栓的形成。这可能得益于藤茶复合汤汁不同植物活性成分，如DHM［23］、丹酚酸［23］、绿原酸［22］及皂苷［22］等对血栓的协同抑制作用［20，24］。

一方面，藤茶DHM 可通过上调平滑肌和颈动脉细胞单核受体的表达促使血管新生内膜形成［20］。此外，藤茶DHM 能够下调血清TNF-α、cytokeratin-18 及成纤维细胞生长因子21 水平［34］，也可提高大鼠血清SOD 水平，降低丙二醛（MDA）含量，防止血管平滑肌细胞的侵袭和基质的降解，抑制动脉粥样硬化［35］。另一方面，丹参中丹参素、丹参酮IIA、丹酚酸A/B 也具有一定的抗血栓作用［36］。丹参酸A 能抑制静态血小板黏附于胶原受体α2β1 特异性合成肽，并抑制可溶性α2β1 与固定胶原在固相中的相互作用［37］。绞股蓝皂苷（gypenoside，GP）可通过NF-kB/MAPKs/AP-1 信号通路降低炎症因子（如IL-6、IL-1β、COX-2 和TNF-α）的表达［38］。研究表明，绞股蓝皂苷可显著降低小鼠血清血脂水平和血栓素A2 水平，抑制肝脏MDA 的形成，增强血清SOD 和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性［39］，也能下调iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA 表达水平［21］。这说明藤茶、丹参和绞股蓝均能通过不同途径降低机体炎症和氧化应激水平、改善血管功能，从而抑制血栓的形成。此外，藤茶复合汤汁中各组分可通过不同途径抑制血栓素的表达。因此，藤茶复合汤汁对血栓的抑制作用强于藤茶汤汁及DHM 溶液。然而，藤茶复合汤汁中DHM、丹参素及皂苷等成分对血栓的抑制作用存在怎样的协同作用，其下调血栓素表达水平的分子机制如何，尚需进一步深入探究。