基于AMPK/mTORC1 自噬通路研究二氢杨梅树皮素对损伤A549 细胞的保护作用

朱海滨，曾春晖，唐木兰，池鑫宇，邓浩健，李雨君，方 静，徐浩亮，杨 柯

（广西中医药大学药学院/广西高校中药药理重点实验室，南宁 530200）

急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）在临床上较常见，可由多种致病因素导致，如烧伤、败血症、误吸、肺创伤等［1，2］。ALI 以弥漫性急性肺部炎症为主要病理特征，涉及先天和适应性免疫细胞的浸润、促炎和抗炎细胞因子平衡的转换［3，4］。近年来，ALI 的发病率和病死率逐步上升［5］。ALI的发病机制多样，其中内毒素是致病的重要因素，其主要成分是脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）［6］，LPS 已被广泛运用于ALI 的动物模型和细胞模型中。研究发现，人肺癌A549 细胞为类Ⅱ型肺泡上皮细胞，使用LPS 诱导后成为研究ALI 相关作用机制的常用体外模型［7］。此外，越来越多的证据表明自噬与ALI 的发生发展过程密切相关［8］。Zhang［9］发现血管紧张素转换酶2 通过调控腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）信号传导自噬改善ALI。

藤茶是葡萄属蛇葡萄科显齿蛇葡萄［Ampelopsis grossedentata（Hand-Mazz）W.T.Wang］的嫩茎叶，为广西一种资源丰富的野生中草药。藤茶主要成分为黄酮类化合物，黄酮类单体成分主要包括杨梅树皮素与二氢杨梅树皮素（Ampelopsin，APS）［10］。APS 具有多种生物学功能，具有清除自由基、抗氧化、抗炎等多 种功 效［11，12］。前 期研 究发现，APS 可以通 过PI3K/Akt-mTOR 自噬通路参与改善和治疗肺纤维化，而ALI 是肺纤维化的一个早期阶段［13］，故推测APS 可能通过调控自噬来改善ALI。本研究基于AMPK/mTORC1 自 噬 通 路，探 讨APS 对LPS 诱 导A549 细胞损伤的保护作用及其机制，以期为治疗ALI提供新依据。

1 仪器、材料与试剂

1.1 仪器

DMIIL 倒置显微镜（德国徕卡公司）；全功能酶标仪（美国BioTek 仪器有限公司）；凝胶化学发光成像系统（美国BIO-RAD 公司）；激光共聚焦显微镜（德国徕卡公司）；DYY-6D 型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

APS（广西中医药大学中药化学教研室提供并鉴定，系从广西藤茶中分离提取，纯度≥98%，为灰白色粉末）；LPS（北京索莱宝科技有限公司，批号320V0315）；AMPK 抑制剂（MedChemExpress 生物科技公司，批号HY-13418A）；F12K 培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号PM150910）；LDH 试剂盒（南京建成生物科技有限公司，批号20210714）；TNF-α 试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号E-EL-H0109c）；MDC 试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号G0170）；自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3（上海吉凯基因化学技术有限公司）；AMPK、p-AMPK、微管相关蛋白1 轻链3（Microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、P62 蛋白（赛默飞世尔科技公司，批号分别为5831T、2535T、2755S、39749S）；mTOR、p-mTOR（武汉三鹰生物技术有限公司，批号分别为66888-1-Ig、67778-1-Ig）；β-actin（美国Proteintech 公司，批号00078629）。

1.3 细胞

人肺癌A549 细胞由广西中医药大学科学实验中心提供。

2 方法

2.1 LPS 与APS 母液配制

LPS 用去离子水溶解得到1 mg/mL 的母液，0.22 μm 微孔滤膜过滤后取滤液，分装，后续用无血清F12K 培养基稀释使用。APS 用无血清F12K 培养基超声波溶解得到1 mg/mL 的母液，0.22 μm 微孔滤膜过滤后取滤液，分装，后续用无血清F12K 培养基稀释使用。

2.2 APS 对LPS 诱导A549 细胞损伤的保护作用

用含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的F12K 培养基培养A549 细胞，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。选择处于对数生长期的细胞，以5×104个/mL 接种量接种于96 孔板内，100 μL/孔，细胞分为正常组、模型组（30 μg/mL LPS）、APS 高中低浓度组（80、40、20 μg/mL APS），每组设置6 个复孔，上述各给药浓度根据前期预试验结果设置。正常组加入无血清F12K 培养基，其余各组加入含LPS 的无血清F12K 培养基，100 μL/孔，培养8 h；弃去培养基，正常组和模型组分别加入无血清F12K 培养基，其余各组分别加入含相应浓度APS 的无血清F12K 培养基，100 μL/孔，培养24 h，再进行相关指标检测。

2.2.1 MTT 法检测细胞存活率 按“2.2”项方法造模、分组及给药，细胞培养结束后，吸出孔内上清液备用，避光每孔加入100 μL MTT（0.5 mg/mL），培养箱中继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入100 μL DMSO，酶标仪检测570 nm 波长处的吸光度，试验重复3 次，细胞存活率计算公式如下：

式中，OA为细胞存活率；a为给药组吸光度；b为正常组吸光度。

2.2.2 微板法检测上清液中LDH 漏出量 取“2.2.1”项中上清液，按照LDH 试剂盒说明书的操作步骤检测LDH 漏出量，试验重复3 次。

2.2.3 ELISA 法检测上清液中TNF-α 含量 取“2.2.1”项中上清液，按照TNF-α 试剂盒说明书的操作步骤检测TNF-α 含量。

2.3 APS 对自噬及AMPK/mTORC1 信号通路的影响

2.3.1 MDC 染色检测自噬体形成量 取对数生长期的细胞，以1×105个/mL 接种量接种于35 mm 玻底培养皿内，2 mL/孔，贴壁24 h 后，按“2.2”项方法造模、分组及给药，细胞培养结束后，弃去皿内液体，Wash buffer 清洗3 次后，每孔加入200 μL MDC 工作液，避光孵育30 min，结束后Wash buffer 清洗3 次，激光共聚焦显微镜下随机选取3 个视野拍照观察。使用Iamge J 6.0 图像处理软件分析染色部位的平均光密度并计算MDC 平均荧光强度，用荧光强度表明自噬体的形成情况。试验重复3 次。

2.3.2 mRFP-GFP-LC3 腺病毒监测细胞自噬流情况 取对数生长期的细胞，以1×105个/mL 接种量接种于35 mm 玻底培养皿内，2 mL/孔，贴壁24 h 后，用感染复数（Multiplicity of infection，MOI）=1 000 的腺病毒感染A549 细胞6 h 后，更换新鲜的10%F12K 培养基培养48 h，按“2.2”项方法造模、分组及给药，细胞培养结束后，激光共聚焦显微镜下随机选取6 个视野拍照观察。此腺病毒用红色荧光蛋白（mRFP）及绿色荧光蛋白（GFP）串联标记LC3，LC3 是自噬体的标记物，自噬体晚期与溶酶体结合成为自噬溶酶体，此时标记LC3 的绿色荧光蛋白会淬灭，表达为红色荧光，自噬体则表达2 种荧光，混合色为黄色。观察红色荧光点和黄色荧光点可反映自噬流的情况。

2.3.3 Western blot 检测蛋白表达水平 取对数生长期的细胞，以1.5×105个/mL 接种量接种于6 孔板内，2 mL/孔，贴壁24 h 后，按“2.2”项方法造模、分组及给药，每组设置3 个复孔。细胞培养结束后，弃去孔内液体，预冷磷酸缓冲盐溶液（Phosphate buffered saline，PBS）清洗3 遍，使用蛋白提取试剂［RIPA（中）裂解液∶磷酸酶抑制剂∶PMSF∶Cocktail=100∶1∶1∶1］提取总蛋白，以4 ℃15 000 r/min，离心20 min，二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法检测上清液蛋白浓度，上样缓冲液变性制备样品。上样20 μg 样品蛋白与3 μL Maker，SDS-PAGE 分离胶电泳，转膜至PVDF 膜上，无蛋白快速封闭液封闭20 min，一抗4 ℃孵育过夜，洗膜，二抗室温孵育2 h，洗膜，使用ECL 显影并扫描，使用Image Lab 6.0 软件分析蛋白条带灰度值。试验重复3 次。

室温孵育2 h，洗膜，使用ECL 显影并扫描，使用Image Lab 6.0 软件分析蛋白条带灰度值。

2.4 AMPK 抑制剂（Compound C，CC）干预验证试验

取对数生长期的细胞，以1.5×105个/mL 接种量接种于6 孔板内，2 mL/孔，细胞分为正常组、模型组、LPS+APS 组、LPS+CC 组、LPS+APS+CC 组，其中LPS 浓度为30 μg/mL，CC 浓度为5 μmol/L，APS 浓度为40 μg/mL，每组设置3 个复孔，上述各给药浓度根据前期预试验结果设置。正常组加入无血清F12K培养基，其余各组分别加入含LPS 的无血清F12K 培养基，培养8 h；弃去培养基，正常组和模型组分别加入无血清F12K 培养基，其余各组分别加入含相应药物的无血清F12K 培养基，培养24 h 后Western blot 检测蛋白表达水平，同“2.3.3”项方法。试验重复3 次。

2.5 统计分析

采用SPSS 22.0 软件进行数据处理分析，数据使用“均值±标准差”来描述。其中多样本计量资料采用单因素方差分析（One way ANOVA），试验中涉及到的所有检验均采用双侧检验（P＜0.05）。

3 结果与分析

3.1 检测A549 细胞存活率、LDH 漏出量、TNF-α含量结果

由表1 可知，与正常组相比，模型组细胞存活率显著降低（P＜0.05），模型组LDH 漏出量、TNF-α 含量均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，APS 高、中浓度组细胞存活率均显著升高（P＜0.05），APS 高、中浓度组LDH 漏出量均显著降低、APS 高、中、低浓度组TNF-α 含量均显著降低（P＜0.05）。

表1 APS 对LPS 诱导的A549 细胞存活率、LDH 漏出量、TNF-α 含量的影响（n=6）

3.2 检测自噬体结果

由表2、图1 可知，与正常组相比，模型组A549细胞的自噬体形成量均无显著差异（P>0.05）；与模型组相比，APS 高、中浓度组细胞的自噬体显著增加（P<0.05），APS 低浓度组细胞的自噬体有所升高，但无显著差异（P>0.05）。

图1 APS 对LPS 诱导的A549 细胞自噬体的影响

表2 APS 对LPS 诱导的A549 细胞自噬体的影响（n=3）

3.3 自噬双标mRFP-GFP-LC3 检测自噬流结果

通过融合表达mRFP-GFP-LC3，可以有效地追踪自噬过程。在激光共聚焦显微镜下，可见mRFPGFP-LC3 聚集在自噬体膜上，以黄色斑点的形式表现，当自噬体与溶酶体融合后，因GFP 荧光部分淬灭而以红色斑点的形式表现。由表3、图2可知，与正常组相比，模型组A549细胞的自噬体均无显著差异（P>0.05），自噬溶酶体也无显著差异（P>0.05）；经过APS干预后，与模型组相比，APS 高、中、低浓度组A549细胞的自噬体均无显著差异（P>0.05），但APS 低浓度组的自噬溶酶体显著增加（P<0.05）。

图2 APS 对LPS 诱导的A549 细胞自噬流的影响

表3 APS 对LPS 诱导的A549 细胞自噬流的影响（n=6）

3.4 检测AMPK/mTORC1 自噬通路相关蛋白表达结果

β-actin 抗体是Western blot 很好的内参指数，由表4、图3 可知，与正常组相比，模型组p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值有所下调，但均无显著差异（P>0.05），P62 蛋白有所上调，但无显著差异（P>0.05）；与模型组相比，APS 高、中、低浓度组的p-AMPK/AMPK 表达均明显上调，pmTOR/mTOR 表达均明显下调，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达均明显上调，P62 蛋白表达均明显下调，APS 中浓度组的P62 蛋白表达显著下调（P<0.05）。

图3 APS 对LPS 诱导的A549 细胞中AMPK/mTORC1自噬通路相关蛋白的影响

表4 APS 对LPS 诱导的A549 细胞中AMPK/mTORC1 自噬通路相关蛋白的影响（n=3）

3.5 AMPK 抑制剂干预后检测AMPK/mTORC1 自噬通路相关蛋白表达结果

由表5、图4、图5 可知，与LPS+APS+CC 组相比，LPS+APS 组A549 细胞的p-AMPK/AMPK 表达显著上调（P<0.05）；与LPS+CC 组相比，LPS+APS+CC 组A549 细胞的p-mTOR/mTOR 表达显著下调（P<0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达显著上调（P<0.05），P62蛋白表达有所上调，但不显著。

图4 AMPK 抑制剂干预后APS 对AMPK、mTOR 蛋白及磷酸化的影响

图5 AMPK 抑制剂干预后APS 对LC3、P62 蛋白的影响

表5 AMPK 抑制剂干预后APS 对AMPK/mTORC1 自噬通路相关蛋白的影响（n=3）

4 小结与讨论

ALI 是一种严重的炎症和损伤性疾病，可引起呼吸衰竭和肺功能受损，死亡率高达40%［14］。前期研究发现，APS 对小鼠ALI 具有良好的改善作用，但其机制并未阐明。本研究采用LPS 诱导A549 细胞损伤，导致细胞存活率下降，LDH 漏出量增多以及炎症因子TNF-α 分泌增多，而APS 干预之后，能够逆转上述改变，提示APS 可以通过降低炎症因子的分泌抑制炎症，对LPS 诱导A549 细胞损伤发挥保护作用。腺苷酸活化蛋白激酶AMPK 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是维持代谢稳态的关键能量传感器，已被证实可诱导自噬的激活。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物（mTORC1）是AMPK 下游重要的信号分子，在自噬调控中发挥负向调节作用［15］。自噬是高度保守的自我分解过程，在维持细胞稳态中发挥重要作用［16］。近年来，越来越多的研究发现，自噬在ALI 的发生、发展中发挥重要的作用。自噬是一个动态并且涉及多个阶段的生理过程，参与自噬过程的主要蛋白被称为自噬相关蛋白，如LC3-II/Atg8、Beclin-1/Atg6、SQSTM1/P62 等［17，18］。评估自噬尚缺乏统一的检测标准，需要借助多项检测方法综合判断，LC3 作为自噬体的重要标志物，是典型的自噬标志蛋白［19，20］。P62 蛋白在自噬中的作用更主要地体现在它作为一个接头蛋白介导其识别底物的降解［21］。MDC 作为一种嗜酸性荧光色素，常被用于检测自噬体形成，MDC 染剂进入细胞后可与自噬囊泡特异性结合，从而对自噬体进行标记，染色后呈绿色荧光，荧光显微镜观察到其分布在细胞质、细胞核周围。自噬双标mRFP-GFP-LC3 腺病毒感染试验能够直观清晰地指示细胞自噬体和自噬溶酶体的形成情况，指征自噬流的水平。

本研究结果显示，与模型组比较，APS 高、中、低浓度组的MDC 染色荧光强度、自噬溶酶体形成量均明显增加、LC3-II/LC3-Ⅰ表达均明显上调、P62 蛋白表达均明显下调，说明对于LPS 诱导的A549 细胞损伤，给予APS 干预后可以激活自噬，增强自噬流。APS 高、中、低浓度组的p-AMPK/AMPK 表达均明显上调，p-mTOR/mTOR 表达均明显下调，说明APS 可能是通过激活AMPK/mTORC1 自噬通路，促进自噬，增强自噬流。

为了验证APS 可以激活AMPK/mTORC1 自噬通路，采用AMPK 抑制剂干预，检测相关蛋白表达水平。结果发现，在AMPK 抑制剂干预下，AMPK/mTORC1 自 噬 通 路 被 抑 制，而APS 干预 后，P62 蛋白、p-AMPK/AMPK、LC3-II/LC3-Ⅰ表达上调和pmTOR/mTOR 表达下调，说明APS 能够重新激活AMPK/mTORC1 自噬通路，促进自噬，增强自噬流。

综上所述，APS 通过激活AMPK/mTORC1 自噬通路、促进自噬和自噬流来发挥对LPS 诱导损伤A549 细胞的保护作用。为进一步了解ALI 保护机制提供新的理论支持和作用靶点。