液质联用法同时测定保健食品中维生素B1、维生素B6、烟酸、烟酰胺和咖啡因的含量

杨玉平，谢柏艳

（武汉药品医疗器械检验所，武汉 430075）

维生素B1（Vitamin B1，硫胺素）、维生素B6（Vitamin B6，吡哆醇）、烟酸、烟酰胺、咖啡因是人体所需的功效成分，参与体内多种代谢活动，适量摄取对人体机能的正常运转具有积极的促进作用［1，2］。维生素B1是人体代谢的重要营养物质，能够促进骨骼生长发育、促进胃肠蠕动，此外，还能有效预防脚气病和心脑血管疾病的发生［3，4］，但是过量摄入会导致消化功能失调，严重危害人体健康。维生素B6参与人体内氨基酸的代谢，有助于血红蛋白的合成，促进糖原分解等，但是长期过量食用会造成神经损害，甚至中毒。烟酸和烟酰胺总称为维生素PP，二者具有同样的生理功能［5］，在维持人体皮肤、消化和神经系统正常功能方面起关键作用［6］，烟酸、烟酰胺过量摄入会导致人体胃肠道不良反应。因此，为了保障人们定量科学地摄入各种维生素，迫切需要建立一种同时准确定量检测保健食品中各种成分（维生素B1、维生素B6、烟酸、烟酰胺、咖啡因）的分析方法。

随着社会经济的发展和人们健康意识的不断增强，添加多种维生素及功效成分的保健食品在市场上层出不穷，但是目前中国保健食品检测标准还不够完善［7］，有时甚至需要参考食品标准［8-10］。常用的检测方法有高效液相色谱法［11-13］、微生物分析法、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS 法）［14-16］等。但高效液相色谱法需要使用离子对试剂，对泵和柱效损害较大、前处理繁琐、有些需要衍生处理、稳定性较差，有机溶剂用量较大，不仅污染环境，而且影响实验人员身体健康。微生物分析方法存在环境要求高、试验周期长、操作繁琐、重复性差等特点，不适用于基质相对简单的保健食品。高效液相色谱-串联质谱法为食品、医药等领域的分析工作开拓了更广阔的前景，质谱检测器可提供可靠、准确的相对分子质量及结果信息，具有灵敏度高、分辨率高、特异性好、重复性好、选择性强、定量准确等优点［17-19］，备受科研人员的青睐。用高效液相色谱-串联质谱法测定保健食品中功效成分的报道较多［20-22］，但采用高效液相色谱-串联质谱法同时测定维生素B1、维生素B6、烟酸、烟酰胺和咖啡因的研究鲜见报道。

本研究建立同时测定保健食品中维生素B1、维生素B6、烟酸、烟酰胺和咖啡因5 种目标化合物含量的高效液相色谱-串联质谱分析方法，为保健食品中5 种目标化合物的快速定量检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

维生素B1、维生素B6（纯度分别为97.0%、100.0%）、咖啡因、烟酸、烟酰胺（纯度分别为99.9%），中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇、甲酸、盐酸均为色谱纯，西班牙Scharlau 公司；乙酸铵为色谱纯，美国Fisher chemical 公司；山楂酵母片、B 族维生素片、多种B 族维生素片、综合营养片（孕妇专用）、褪黑素片、多种维生素矿物质咀嚼片（儿童型）、黄山灵芝孢子粉、蜂胶软胶囊、保健口服液9 种保健食品为市售商品，样品剂型包括片剂、软胶囊剂、口服液等。

API4000 型三重四极杆质谱仪，美国AB 公司；Milli-Q 超纯水系统，美国Millipore 公司；SK8200HP型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；Capcell Pak C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）色谱柱，日本资生堂投资有限公司；Waters atlantis T3（150 mm×2.1 mm，3 μm）色谱柱，沃特世科技（上海）有限公司；GLSciences intersil ODS-SP（150 mm×2.1 mm，5 μm）色谱柱，技尔（上海）商贸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理 将20 粒片剂或胶囊试样粉碎后混匀，液体试样混合均匀。精密称取上述处理好的试样1 g，置于50 mL 棕色容量瓶中，加去离子水40 mL，超声波处理10 min，冷却至室温，去离子水定容至刻度，摇匀，0.22 μm 滤膜过滤留上清液，待测。操作过程在避光环境中进行，选取无干扰峰的空白基质溶液（不含目标化合物的样品，与样品相同处理方法得到的提取液），用于回收率添加试验。

1.2.2 工作溶液的制备

标准储备溶液：分别精密称取维生素B1、维生素B6标准品0.1 g（精确至0.000 1 g），用0.01 mol/L 盐酸溶液溶解并定容于100 mL 棕色容量瓶。

标准品工作溶液：分别精密移取维生素B1、维生素B6、烟酸、烟酰胺、咖啡因标准储备溶液适量，用去离子水稀释成含量为1 000 μg/L 的标准品工作溶液。

基质混合标准工作溶液：准确吸取维生素B1、维生素B6、烟酸、烟酰胺、咖啡因标准储备液适量，用空白基质溶液将其稀释成含量分别为5、10、20、50、100、200、500 μg/L 的基质混合标准工作溶液。

1.2.3 高效液相色谱-串联质谱条件

1）高效液色谱条件。色谱柱：Capcell Pak C18、Waters atlantis T3 色谱柱；GLSciences intersil ODSSP。流动相包括0.1%甲酸溶液-甲醇溶液、0.1%甲酸溶液-乙腈溶液、10 mmol/L 乙酸铵（0.1%甲酸）溶液-甲醇溶液、10 mmol/L 乙酸铵（0.1%甲酸）-乙腈溶液、0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸甲醇溶液、0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸乙腈溶液；柱温：25、30、35、40 ℃；进样量：10 μL；流速：0.2 mL/min，梯度洗脱条件见表1。

表1 高效液相色谱梯度洗脱条件

2）质谱条件。本研究分别采用去离子水、0.1%甲酸溶液、0.01 mol/L 的盐酸溶液进行质谱条件的选择。离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子模式；监测模式：多反应监测（MRM）；喷雾电压：5 000 V；离子源温度：500 ℃。5 种目标化合物的保留时间和质谱条件见表2。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 色谱柱 结合目标化合物的性质，本研究分别考察Waters atlantis T3、GLSciences intersil ODSSP、Capcell Pak C18 色谱柱。结果表明，Waters atlantis T3 分离时峰型较好，但烟酸、烟酰胺不能完全分离；GLSciences intersil ODS-SP 分离时咖啡因色谱峰出现拖尾，烟酸、烟酰胺和维生素B6分离效果不好；Capcell Pak C18 对5 种目标化合物都能完全分离，各峰峰型也比较尖锐对称。综合考虑，本试验最终选择色谱柱Capcell Pak C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）。

2.1.2 流动相 本研究考察了流动相分别为0.1%甲酸溶液-甲醇溶液、0.1%甲酸溶液-乙腈溶液、10 mmol/L 乙酸铵（0.1% 甲酸）溶液-甲醇溶液、10 mmol/L 乙酸铵（0.1%甲酸）-乙腈溶液、0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸甲醇溶液、0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸乙腈溶液时5 种目标物的分离效果。结果表明，流动相为甲醇-水体系时仪器响应优于乙腈-水体系，流动相中加入适当浓度的乙酸铵可改善目标化合物的分离，但是导致烟酸、烟酰胺的响应降低，正离子模式中加入甲酸可显著提高目标化合物的分离效果，使峰型更尖锐，响应增强。综上，本研究选取0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸甲醇溶液为流动相。在选定的流动相下各组分得到良好的分离。5 种目标化合物的总离子流见图1。

图1 5 种目标化合物总离子流

2.1.3 柱温的选择 本研究考察了柱温对分离度和仪器响应的影响。结果表明，在25、30 ℃柱温条件下，5 种目标化合物都能实现完全分离，但是25 ℃柱温时响应值和稳定性低于30 ℃柱温，35 ℃柱温时烟酸、烟酰胺、维生素B63 种目标化合物的分离度下降，40 ℃柱温时烟酰胺和维生素B6的色谱峰会部分重叠，不能完全分离。综合考虑分离度和仪器响应，本试验最终选取30 ℃柱温。

2.2 质谱条件优化

图2 为标准溶液中5 种目标化合物的定量离子对色谱。以0.2 mL/min 的流速向质谱仪中注入目标化合物，确定其最佳质谱条件，5 种化合物均能形成［M+H］＋准分子离子峰。取标准品工作溶液分别进行母离子扫描和子离子扫描，优化锥孔电压（DP）和碰撞能量（CE），并在每个母离子中选取2 个或3 个子离子，组成离子对信息；选取最稳定、抗干扰能力强的离子对作为定量离子对，另外一对或两对离子对作为定性离子对。5 种目标化合物在ESI+模式下均可获得较高丰度的［M+H］＋准分子离子峰。

2.3 方法学考察

2.3.1 基质效应检验 基质效应（Matrix effect，ME）是指目标物经由热进样口向色谱柱传输过程中由于基质的参与减少了热不稳定目标物的分解，或者由于基质屏蔽了进样口的活性位点，从而减少了极性目标物被活性位点吸附，从而影响成分复杂样品定性定量分析结果的重现性和准确度。具体影响表现在仪器响应值上，即化合物的信号强弱。目前普遍认为，液相色谱-串联质谱基质效应是在质谱离子源中样品离子化时内源性或外源性的基质物质与目标化合物竞争电荷或中和离子化引起的［23，24］。空白基质匹配标准校正法是理化分析中补偿基质效应的常用方法［25，26］。选取合适的基质样品，按照“1.2.1”项方法制备空白基质溶液。按照“1.2.2”项方法将标准品（维生素B1、维生素B6、烟酸、烟酰胺、咖啡因）配成各浓度的基质混合标准工作溶液，制作标准曲线。上述得到的标准曲线用于对检测结果校正，基质效应的计算公式如下：

式中，ME为基质效应的值；A为纯溶剂中化合物的响应值；B为样品基质中添加相同含量目标化合物的响应值。

ME> 1 时基质增强效应，ME< 1 时基质抑制效应，ME=1 时没有基质效应。由图3 可知，烟酰胺和维生素B6存在基质增强效应，而维生素B1、咖啡因存在基质抑制效应。

图3 5 种目标化合物的基质响应值和溶剂响应值

2.3.2 线性方程、定量限 选取空白样品，按照“1.2.1”和“1.2.2”项方法制备空白基质溶液，配成质量浓度分别为5、10、20、50、100、200、500 μg/L 的基质混合标准工作溶液进样分析。以各目标化合物的响应信号强度为纵坐标（y），对应目标化合物的浓度为横坐标（x）进行线性回归。由表3 可知，5 种目标化合物的线性范围为5~500 μg/L，相关系数（R2）均大于0.990 0。维生素B1、烟酸、烟酰胺、维生素B6和咖啡因的定量限分别为2.10、3.93、5.46、4.47、1.53 μg/kg，满足实际检测需求。

表3 5 种目标化合物的回归方程、相关系数、检出限及定量限

2.3.3 回收率和精密度 为了考察方法的回收率和精密度，对维生素B1、维生素B6、烟酸、烟酰胺、咖啡因5 种目标化合物进行检测，本研究选取片剂、口服液样品分别做回收率试验。对于片剂，称取阴性样品1 g，精密加入标准品储备溶液，最终的质量浓度分别为0.25、0.50、1.00 μg/g。口服液样品空白样品量取1 mL，精密加入标准品储备溶液，最终的质量浓度分别为0.25、0.50、1.00 μg/g。重复测定6 次，计算不同添加水平的回收率和相对标准偏差（RSD）。由表4 可知，维生素B1、维生素B6、烟酸、烟酰胺、咖啡因5 种目标化合物的平均回收率为75.4%~94.5%，相对标准偏差为1.1%~15.6%，表明该方法回收率和精密度可满足试验要求。

表4 5 种目标化合物的回收率和相对标准偏差

2.4 样品测定结果

取保健食品样品，按照优化的前处理方法和分析测定方法操作，外标法定量。由表5 可知，山楂酵母片检出烟酸（62.0 mg/kg）、烟酰胺（55.0 mg/kg）、咖啡因（5.1 mg/kg）、维生素B1（27.0 mg/kg）、维生素B6（5.1 mg/kg）；B族维生素片检出烟酸（12 020.0 mg/kg）、维生素B1（7 000.0 mg/kg）、维生素B6（12 840.0 mg/kg）；多种B 族维生素片检出烟酰胺（46 040.0 mg/kg）、维生素B1（19 290.0 mg/kg）、维生素B6（10 020.0 mg/kg）；综合营养片（孕妇专用）检出烟酰胺（13 900.0 mg/kg）、维生素B1（10 710.0 mg/kg）、维生素B6（15 080.0 mg/kg）；褪黑素片检出维生素B6（7 040.0 mg/kg）；多种维生素矿物质咀嚼片（儿童型）检出烟酰胺（1 940.0 mg/kg）、维生素B1（64.0 mg/kg）、维生素B6（84.0 mg/kg）；保健口服液检出烟酸（0.7 mg/kg）、烟酰胺（3.1 mg/kg）。

表5 保健食品中5 种目标化合物的分析结果 （单位：mg/kg）

3 小结

基于本研究建立的高效液相色谱-串联质谱，实现了同时对保健食品中维生素B1、维生素B6、烟酸、烟酰胺和咖啡因含量的检测。结果表明，通过选用优化后的高效液相色谱条件和质谱条件，在MRM扫描模式下，5 种目标化合物分离度较好，且抗干扰能力强，并通过对该方法的检出限、空白试验、线性范围、定量限、回收率试验确认，证明该方法能同时准确快速地检测保健食品中维生素B1、维生素B6、烟酸、烟酰胺、咖啡因含量。与现行国家标准［7］相比，具有快速、简单、准确、灵敏度高等特点，有助于提高实验室的分析效率，确保产品质量，降低成本，为保健食品中维生素B1、维生素B6、烟酸、烟酰胺、咖啡因的同时检测提供技术支持。