一株望天树根际高效解磷细菌解磷能力的研究

田 湘，韩小美，黄平升，李万年，杨钦潮，杨 梅

（1.广西南宁良凤江国家森林公园，南宁 530004，2.广西大学林学院，南宁 530004）

磷元素对植物生长具有重要影响，其在植物的光合作用、呼吸作用等方面均发挥着重要的作用，同时还能够促进植物根系的发育，对苗木初期的生长影响较大［1］。中国南方大部分土壤呈酸性，土壤中具有较高的磷含量，但由于酸性土壤对磷有强烈固化作用，绝大多数磷是以核酸、卵磷脂、磷灰石的形式存在于土壤中，并与土壤中的Al3+、Ca2+、Fe3+等离子结合成难溶性磷化合物［2，3］，土壤中能够被植物直接吸收利用的磷不足5%，很难满足植物生长的需求［4］。当植物体内缺少磷元素时，植株会出现生长缓慢、根系发育迟缓、光合能力减弱、抵抗力下降等现象。

解磷菌又被称作溶磷菌，能够将土壤中难溶性的磷转化成植物自身可从土壤中吸收利用的有效磷，能够部分解决土壤有效磷低的问题，因此从土壤中筛选高效解磷菌生产生物肥料可减少土壤化肥的使用，防止土壤板结，增强土壤肥力，促进林木根系的生长［5-7］。研究发现在马尾松根际土壤中黄褐假单胞菌溶磷效果最佳，该菌具有较大的应用潜力，可作为生物菌肥的优良菌株［8］。徐睿等［9］在降香黄檀根际土壤中筛选到19 株解磷菌，其中有3 株菌株溶磷量在170 μg/mL 以上，同时有2 株菌株具有分泌IAA 能力。崔邢等［10］的研究发现，不同土壤条件下的巨尾桉经过根际土壤高效解磷菌处理后，其土壤中有效磷含量显著提升。可见从林木根系土壤中分离、筛选解磷细菌是制备目标树种生物菌肥、活化林地土壤难溶性磷、提高有效磷利用率的重要途径。

望天树（Parashorea chinensisWang Hsie.）又名擎天树，是龙脑香科柳安属植物，热带雨林标志种及濒危树种，国家一级重点保护野生植物［11］，云南省和广西壮族自治区为其主要分布地区。望天树具有很高的科学价值和经济价值，通过前期研究及生产实践发现，望天树苗木在苗期时根系发育迟缓，侧根发育不发达，导致苗期生长缓慢、存活率低。本试验以望天树人工林为研究对象，通过分离、筛选、鉴定望天树根际高效解磷菌，探讨其解磷能力，以期为望天树苗期和幼树根系发育迟缓、生长较慢的问题提供有效办法，对提高望天树人工林栽培技术和森林质量、加速广西壮族自治区珍贵树种基地建设和发展均具有重要的理论价值和应用前景。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试细菌菌株为解无机磷细菌洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia），编号为P4，保存于中国科学院微生物研究所。该菌株分离于广西南宁树木园2019 年造林的望天树根际土壤中，通过筛选和功能评价已证实该菌株具有较好的降解无机磷特性。

1.2 培养基

无机磷液体培养基：葡萄糖10.000 g，（NH4）SO40.500 g，酵母浸粉0.500 g，NaCl 0.300 g，KCl 0.300 g，MgSO4·7H2O 0.300 g，FeSO4·7H2O 0.030 g，MnSO4·H2O 0.022 g，Ca3（PO4）25.000 g，蒸 馏 水1 000 mL，pH 7.0~7.5。

无机磷固体培养基：琼脂15 g，其他与液体培养基相同。

种子培养基（LB）：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，定容至1 000 mL，pH 7.0~7.5。

1.3 试验方法

1.3.1 解磷菌解磷能力、pH 的测定 将待测菌株接种于50 mL 的LB 培养基中培养24 h，吸取1 mL 菌液接种到1 00 mL 无机磷液体培养基中，以不接菌为对照，每个处理设置3 个重复，28 ℃、170 r/min 培养168 h，每天取样10 mL 检测菌液pH 和有效磷含量，用pH 计直接测定pH，将培养液于4 ℃下6 000 r/min离心10 min，取上清液采用钼锑抗比色法测定菌液中有效磷含量。

1.3.2 不同温度条件下菌株解磷量的测定 将待测菌液接种于50 mL 的LB 培养基中培养24 h 后，吸取菌液1 mL 接种到无机磷液体培养基中，分别置于10、15、20、25、30、35、40、45 ℃温度下摇瓶培养，以不接菌为对照，每个处理设3 个重复，170 r/min 培养168 h，采用钼锑抗比色法测定菌液中有效磷含量。

1.3.3 不同pH 条件下菌株解磷量的测定 灭菌前将无机磷液体培养基初始pH 调至3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 和8.5，灭菌后吸取1 mL 培养24 h 的菌液接种到无机磷液体培养基中，以不接菌为对照，每个处理设3 个重复，170 r/min 培养168 h，采用钼锑抗比色法测定菌液中有效磷含量。

1.3.4 不同碳源条件下菌株解磷量的测定 将无机磷液体培养基中的葡萄糖用含碳量相等的乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇替换，分装于150 mL 三角瓶中，每瓶30 mL，121 ℃高温灭菌20 min，不同碳源培养基中的接种量和摇床培养条件同上，培养168 h 后测定菌液中有效磷含量。

1.3.5 不同氮源条件下菌株解磷量的测定 将无机磷液体培养基中的硫酸铵用含氮量相等的尿素、硝酸钾、硝酸钠、草酸铵替换，分装于150 mL 三角瓶中，每瓶30 mL，121 ℃高温灭菌20 min。不同氮源培养基中的接种量和摇床培养条件同上，培养168 h后测定菌液中有效磷含量。

1.3.6 不同碳氮比（C/N）条件下菌株解磷量的测定 分别以无机磷液体培养基中葡萄糖和硫酸铵为碳源、氮源，将C/N 比调至40∶1、20∶1 和8∶1，分装于150 mL 三角瓶中，每瓶30 mL，121 ℃高温灭菌20 min。不同C/N 培养基中接种量和摇床培养条件同上，培养168 h 后测定菌液中有效磷含量。

1.3.7 不同盐浓度条件下菌株解磷量的测定 配制NaCl 浓度为0、0.5%、1.5%、2.5%、5.0%、10.0%的无机磷液体培养基，分装于150 mL 三角瓶中，每瓶30 mL，121 ℃高温灭菌20 min。不同NaCl 浓度培养基中接种量和摇床培养条件同上，培养168 h 后测定菌液中有效磷含量。

1.4 数据处理

采用SPSS19.0 软件对数据进行差异显著性和相关性分析，采用Microsoft Excel 2003 软件作图。

2 结果与分析

2.1 解磷细菌P4 解磷能力和菌液pH 的动态变化

由图1 可知，菌株P4 菌液中有效磷含量在培养48~72 h 时增长速率最快，说明菌株P4 在培养48~72 h 时解磷能力最佳，随后在培养72~120 h 增长速率减小，但菌液中有效磷含量仍处于增长状态，在培养120 h 时P4 有效磷含量达最高，为552.87 mg/L，120 h 后菌液中有效磷含量开始下降，在168 h 时菌液中有效磷含量降至428.48 mg/L，解磷量较120 h时降低了22.50%。在培养168 h 内菌株P4 菌液pH呈先下降后稍有上升的趋势，在培养48~72 h 菌株菌液pH 下降最快，在培养120 h 时菌液pH 达最低，为4.95，120 h 后菌液pH 略微升高。

图1 菌株P4 解磷能力和菌液pH 的动态变化

由图2 可知，解无机磷细菌P4 解磷量与菌液pH间呈显著的负相关关系，即解磷细菌溶解无机磷量越高，其菌液的pH 越低，说明菌株在溶解无机磷过程中会分泌酸性物质，使菌液pH 降低，进而达到溶解无机磷的效果。

图2 菌株P4 解磷量与菌液pH 的关系

2.2 不同培养条件对望天树根际解磷细菌解磷能力的影响

2.2.1 温度对菌株P4 解磷能力的影响 温度对微生物的生长和代谢具有重要影响，当温度在微生物适宜的范围内变化时，微生物生长和代谢正常且平稳，当温度超过适宜范围时，微生物生长代谢缓慢甚至停滞死亡。为使菌株较好地发挥其解磷能力，本试验对不同温度下解磷细菌P4 解磷能力进行研究。由图3 可知，菌株P4 在30 ℃时菌液中有效磷含量最高，为552.87 mg/L，其次为25 ℃和35 ℃有效磷含量，分别为472.68 mg/L 和500.98 mg/L；在25、30、35 ℃时菌株P4 菌液中有效磷含量明显高于其他温度条件下的，说明菌株P4 的最适解磷温度范围为25~35 ℃且最佳解磷温度为30 ℃。

图3 温度对菌株P4 解磷能力的影响

2.2.2 pH 对菌株P4 解磷能力的影响 pH 的变化会造成培养环境中营养物质离子浓度发生变化，从而间接影响菌株从培养液中吸收营养物质，同时pH 还会影响酶活性，菌株体内的所有代谢过程都需要酶的参与，pH 通过影响酶活性进而间接影响菌株体内的代谢过程，从而说明了pH 的变化对菌株的生长和繁殖具有重要影响。

由图4 可知，解无机磷细菌P4 在不同pH 条件下解磷能力不同，pH 为3.5 时菌株P4 表现为较低的解磷能力，说明菌株在强酸环境下不利于其生长，同时也不利于其发挥解磷能力，随着pH 的升高，菌株菌液中有效磷含量呈先升高后降低的趋势，在pH 为6.5 时菌液中有效磷含量最高，为551.83 mg/L，说明在弱酸环境下菌株P4 的解磷能力较强。

图4 pH 对菌株P4 解磷能力的影响

2.2.3 碳源对菌株P4 解磷能力的影响 组成生物细胞最基本的元素是碳源，生物体内的各种代谢活动均离不开碳源，同时碳源也是细胞内物质储藏的主要原料。本研究选取5 种常见的糖类碳源，分别为葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘露醇作为培养基的碳源，探讨在5 种碳源条件下菌株P4 的解磷效果。从图5 可以看出，不同碳源条件下，菌株P4解磷能力不同，其解磷能力大小顺序为乳糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇，在以乳糖为碳源时解磷量为500.98 mg/L，显著高于其他碳源（P<0.05），其次为葡萄糖和蔗糖，二者差异不显著，在以甘露醇为碳源时解磷量最低，为130.54 mg/L，与乳糖相比，在以甘露醇为碳源时菌株解磷量降低了73.94%，说明菌株P4 对碳源的利用均以单糖和双糖为主，对多糖的利用效率较低，5 种碳源中菌株P4 在以乳糖为碳源时解磷量最高，说明菌株P4 的最佳碳源为乳糖。

图5 碳源对菌株P4 解磷能力的影响

2.2.4 氮源对菌株P4 解磷能力的影响 氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素。由图6 可知，在5 种不同的氮源中，菌株P4 解磷能力大小顺序为草酸铵、硫酸铵、尿素、硝酸钠、硝酸钾，在以草酸铵为氮源时菌株P4解磷量最高，为477.37 mg/L，其次为硫酸铵，为453.36 mg/L，在以硝酸钾和硝酸钠为氮源时解磷量较低，说明菌株P4 在以铵态氮为氮源时解磷效果较好，且在以草酸铵为氮源时解磷效果最好，在硝态氮为氮源时解磷效果较差。综上可知，菌株P4 的最佳氮源为草酸铵。

图6 氮源对菌株P4 解磷能力的影响

2.2.5 C/N 对菌株P4 解磷能力的影响 不同的C/N条件下菌株P4 的解磷能力变化如图7 所示。由图7可 知，菌 株P4 在C/N 为20∶1 时 解 磷 量 最 高，为526.87 mg/L，说明菌株P4 的最适C/N 为20∶1，其次为40∶1，在C/N为8∶1时解磷量最低，在C/N为20∶1时菌株解磷量是C/N 为8∶1 时解磷量的2.28 倍，说明C/N 为8∶1 的培养条件不利于菌株发挥其解磷能力。

图7 C/N 对菌株P4 解磷能力的影响

2.2.6 盐浓度对菌株P4 解磷能力的影响 由图8可知，当NaCl 浓度达2.5%时，菌株P4 菌液仍具有较高的有效磷含量，说明在NaCl 浓度为2.5%时菌株P4 仍具有较好的耐盐能力，当NaCl浓度继续升高达5.0%时，P4 菌液中有效磷含量显著降低，当NaCl 浓度达10.0%时，菌株P4 有效磷含量降至最低，由此可知菌株具有一定的最适NaCl 浓度范围，过高浓度的NaCl会显著抑制菌株的解磷能力。从图8 可以看出，菌株P4 的最适NaCl浓度范围为0~2.5%，在NaCl浓度为0.5%时解磷能力最强，菌液中有效磷含量为349.15 mg/L，说明P4 的最适盐浓度为0.5%，在NaCl浓度为0.5% 时菌株P4 的解磷量是NaCl 浓度为10.00%时解磷量的66.85 倍。

图8 盐浓度对菌株P4 解磷能力的影响

3 讨论

3.1 望天树根际解磷细菌解磷能力与培养液pH 变化的关系

菌株P4 溶解无机磷量为24.96~552.87 mg/L，林启美等［12］的研究发现，解磷细菌在磷矿粉（磷酸钙）培养基中培养5 d后，菌株溶磷量最高为11.73 mg/L。从北方黑土区的美青杨林、水曲柳林、落叶松林和樟子松林4 种林地土壤中筛选的具有较强解无机磷能力的2株溶磷菌的溶磷量分别为0.90、0.18 mg/L［13］，南方红树林根际土壤中筛选出1株具有较强解Ca3（PO4）2能力的菌株，其溶磷量为90.95 mg/L［14］，而本研究在望天树根际筛选的解无机磷菌株P4 的解磷能力明显高于黑土区4 种林地土壤中解磷细菌和红树林根际土壤解磷能力以及林启美等［12］的研究结果。综合对比可知，本研究中在望天树根际筛选的解磷菌具有较好的解磷能力，但本研究中只选择了Ca3（PO4）2作为磷源，为了更好地筛选出解磷能力较强的菌株，在后续研究中，条件允许的情况下可增加多种无机磷源培养基。

本研究表明，解无机磷细菌培养液中的溶磷量与菌液pH 呈极显著的负相关关系，该结论与白文娟等［15］的结果一致。已有研究发现，菌株在以无机磷Ca3（PO4）2为磷源的解磷过程中，培养基溶磷量与pH呈显著负相关［16］，解磷菌在溶解无机磷的同时菌液中会有多种有机酸产生［17，18］，解磷菌分泌的主要有机酸是葡萄糖酸，其次还有乙酸、柠檬酸、乳酸等多种有机酸［19-21］，其会使菌液的pH 降低，同时与铁、铝、钙、镁等离子通过螯合作用结合，使磷酸根从难溶性磷酸盐中溶解出来，进而使土壤中难溶性磷转化为有效磷［22］，因此无机磷细菌培养液中溶磷量与pH 呈极显著负相关。解有机磷细菌解磷机理与无机磷有所不同［23］，李文红等［24］在对以卵磷脂为磷源筛选出的解有机磷菌株菌液pH 的测定时发现，菌株在溶解有机磷过程中，其菌液pH 高于对照，说明其解磷机制不在于菌体分泌的有机酸，而是由于菌株在溶解有机磷过程中，菌体分泌了磷酸酶的作用。可见，菌株不同其解磷机制也不相同。

3.2 望天树根际解磷细菌解磷能力与外界环境的关系

温度和pH 是影响微生物生长和代谢的重要因素，不同菌株由于其自身的生理生化特性不同，所以其最佳解磷温度和pH 也不同，本研究中的菌株P4在温度为30 ℃、pH 为6.5 时解磷能力最好。孙薇等［25］在对土壤有机磷降解菌的筛选鉴定和生长特性的研究中发现，卵磷脂降解菌的最适温度为28 ℃，最适pH 为7.5。油茶根际解无机磷细菌WB38 的最佳培养温度为28 ℃，最适pH 为6.5［26］。本研究中在望天树根际筛选的的P4 菌株的最适pH为弱酸性，而中国南方土壤大部分偏酸性，因此在后续的生产应用制备微生物菌肥时，应考虑通过调节肥料的pH 来改善林木根际环境的酸度，并考虑解磷菌发挥最佳解磷活性的环境温度，从而充分发挥菌肥的解磷能力。

不同碳源对菌株的解磷能力影响很大，本研究从望天树根际筛选得到解无机磷细菌P4 的最适碳源为乳糖，在碳源为甘露醇时解磷效果最差，可知菌株对单糖和双糖具有较好的利用，对多糖的利用率较低。Banik 等［27］研究了解磷微生物在葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乙酸钠4 种不同碳源中的解磷能力，结果发现在较短的时间内，解磷微生物在以葡萄糖为碳源时解磷效果最好，长时间内以蔗糖为碳源解磷效果最好。柯春亮等［28］研究了3 株香蕉根际具有代表性的解磷菌株B3-5-6、M-3-01 和T1-4-01 在以葡萄糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、甘油、乳糖作为碳源时的解磷能力，结果得出菌株B3-5-6、M-3-01 和T1-4-01 的最适碳源分别为蔗糖、葡萄糖和乳糖，菌株对单糖和双糖的利用率高于多糖，与本研究结果相似。与多糖相比，菌株对单糖的利用效率更高，主要是由于糖类不同的结构所导致，多糖的结构更复杂，进而导致菌株在利用多糖时需要酶的种类和数量更多，过程更长，菌株由于复杂的细胞代谢过程进而导致生长缓慢，其相应的解磷能力也较差［23］。不同氮源对解磷菌的解磷能力影响也很大，本研究中菌株P4 在以草酸铵为氮源时解磷效果最好，说明菌株P4 在以铵态氮为氮源时解磷效果最好。Illmer等［29］在研究氮源对解磷菌金黄色青霉菌和假单胞菌溶解无机磷酸盐能力中发现铵态氮是解磷菌株的必要氮源；刘文干等［22］从花生根际分离得到1 株溶解无机磷酸盐菌株C5-A，对其解磷条件进行研究发现，与硝态氮和尿素相比，菌株对铵态氮的利用效果更好。赵小蓉等［30］的研究发现节杆菌1TCRi7 和1TCRi14 在以NO3-为氮源时解磷活性降低，且只有在NH4+存在时，肠杆菌1TCRi15 和欧文氏菌4TCRi22 才具有溶解磷矿粉的能力。从以上的研究可见，氮源的不同对菌株的解磷效果具有显著的影响，以上学者研究均表明，解磷菌株在铵态氮为氮源时溶解磷酸盐效果最好，与本研究结果一致。

4 小结

本研究以1 株来源于广西南宁树木园2019 年造林的望天树根际土壤的高效解无机磷细菌P4（鉴定为洋葱伯克霍尔德菌）为材料，对其培养168 h 内解磷能力和菌液pH 动态变化情况和不同环境条件下的解磷量进行研究，结果表明菌株P4 在培养120 h时解磷量达最高，说明培养120 h 为菌株P4 的最佳解磷时间；对菌株P4 解磷量和菌液pH 进行相关性分析表明，菌株P4 解磷量与培养液pH 间存在极显著的负相关。不同培养条件研究表明，菌株P4 在温度为30 ℃、pH为6.5、碳源为乳糖、氮源为草酸铵、C/N为20∶1、NaCl浓度为0.5%时解无机磷效果最好。