厚朴花（厚朴）配方颗粒指纹图谱及含量测定研究*

许豪杰，赵淑淑，俞 杰，黄 琪，俞思阳

（浙江佐力药业股份有限公司，浙江湖州 313200）

厚朴花为木兰科植物厚朴Magnolia officinalisRehd.et Wils. 或凹叶厚朴Magnolia officinalisRehd. et Wils.var.bilobaRehd.et Wils. 的干燥花蕾。厚朴花为芳香化湿药［1］，味苦，性辛、温，归脾、胃、肺、大肠经，燥湿行气，消积平喘，临床主要治疗湿阻、气滞、食积导致的脘腹胀满、痰饮喘咳、梅核气等。厚朴花中主要成分有异厚朴酚、和厚朴酚、厚朴酚、四氢厚朴酚等［2-5］。厚朴花（厚朴）配方颗粒以厚朴花为原料，经炮制、水提、浓缩、干燥等工序制备而成。目前尚无关于厚朴花（厚朴）配方颗粒质量研究的报道。为此，本研究中对厚朴花（厚朴）配方颗粒中厚朴酚、和厚朴酚的含量测定及指纹图谱进行研究，为配方颗粒质量标准的建立提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；SX205 型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为十万分之一）；FA2004B 型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司，精度为万分之一）；KQ-500型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，功率为250 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

厚朴花（厚朴）配方颗粒（自制样品，批号分别为20031151，20031152，20031153，20031154，编号为SⅠ-SⅣ）；甲醇（分析纯，北京化工厂有限责任公司）；水为超纯水；和厚朴酚对照品（批号为110730 - 201614，含量为99.3%），厚朴酚对照品（批号为110729-201714，含量为99.3%），厚朴花（厚朴）对照药材（批号为121285 -201303），均购自中国食品药品检定研究院；标准汤剂药材信息见表1。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Welch Ultimate XB C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.5%醋酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min时10%A →90%A，5～10 min时90%A →13%A，10～22 min 时13%A →20%A，22～40 min 时20%A →30%A，40～45 min时30%A →70%A，45～50 min时70%A，50～60 min 时70%A →95%A，60～70 min 时95%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：294 nm；柱温：30 ℃；进样量：10µL。

2.1.2 标准汤剂与溶液制备

饮片标准浸膏（汤剂）：依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，并结合《医疗机构中药煎药室管理规范》中药煎煮方法相关操作规范及文献对汤剂煎煮的要求进行煎煮，取饮片100 g，置市售煎药锅中，加水煎煮2次，第1次加入饮片量12倍的水，搅拌使浸润，浸泡30 min，大火加热至微沸，转小火煮沸30 min，药液用100目不锈钢筛过滤；第2次加入饮片量10倍的水，大火加热至微沸，转小火煎煮20 min，药液用100 目不锈钢筛过滤；合并2 次滤液，滤液置旋转蒸发器中，50～60 ℃减压浓缩至浓缩液体积约为1∶1的浸膏，冷冻干燥，即得。

混合对照品溶液：取厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含厚朴酚、和厚朴酚各10µg的溶液，即得。

供试品溶液：取样品1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声（功率为250 W，频率为40 kHz）处理30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：取辅料1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声（功率为250 W，频率为40 kHz）处理30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 方法学考察

为了对上面的假设进行验证，下面通过改变UD00值的大小：分别取值为2 520 N、3 020 N、3 520 N、4 020 N，来仿真不同负载下通过活塞流量数值的大小(图7)。

专属性试验：取样品（批号为20031152），依法制备供试品溶液；取2.1.2项下混合对照品溶液和阴性对照品溶液各适量，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果阴性对照品溶液色谱中，在与厚朴酚、和厚朴酚相应的保留时间处均无色谱峰出现，表明辅料对指标成分的测定无干扰。

稳定性试验：取专属性试验项下供试品溶液，分别于室温下放置0，3，6，9，12，18，24 h 时按2.1.1 项下色谱条件进样测定，与标准汤剂的对照图谱进行比对，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）对相似度进行评价。结果相似度均大于0.900，RSD小于2.0%（n= 7），表明供试品溶液在室温下放置24 h 内稳定性良好。

耐用性试验：考察3种流速、柱温、色谱柱对本色谱条件的耐用性。由表2 可知，不同流速、柱温、色谱柱条件下测定结果基本一致，色谱图中各共有峰峰形尖锐、对称，分离度良好，相似度均不低于0.900，RSD均小于2%。供试品溶液指纹图谱中呈现4 个共有峰，表明不同流速、柱温、色谱柱的耐用性良好。

表2 指纹图谱耐用性试验结果Tab.2 Results of the durability test for the HPLC fingerprint

2.1.4 高效液相色谱指纹图谱建立和共有峰指认

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版），以16批厚朴花标准汤剂的色谱峰进行自动匹配，以峰3（和厚朴酚）为对照峰，形成共有模式图，并建立对照图谱，共标定4 个共有峰，相对保留时间的RSD为0.01%～1.01%，表明不同产地的饮片制成的标准汤剂具有相似的成分，且所含化学成分含量无显著差异。详见图1和图2。

图1 16批标准汤剂高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.1 HPLC overlay fingerprints of 16 batches of standard decoction

图2 标准汤剂高效液相色谱对照指纹图谱Fig.2 HPLC reference fingerprint of standard decoction

取2.1.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，共指认4 个共有峰，其中峰3（S）为和厚朴酚，峰4为厚朴酚。详见图3。

图3 混合对照品溶液高效液相色谱图3.Magnolol 4.HonokiolFig.3 HPLC chromatogram of mixed reference solution

2.1.5 相似度评价

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版），以共有峰对16批样品与对照指纹图谱的相似度进行计算，结果相似度均不低于0.900，表明标准汤剂一致性良好。详见表3。

表3 16批标准汤剂相似度评价结果Tab.3 Similarity evaluation results of 16 batches of standard decoction

取4批（编号分别为SⅠ-SⅣ）样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，与对照图谱进行比对，色谱图见图4。各共有峰相对保留时间与对照指纹图谱基本一致，重复性较好，4 批样品与对照指纹图谱的相似度分别为0.958，0.972，0.994，0.982，均大于0.900，表明建立的指纹图谱可用于配方颗粒的质量分析。

图4 4批配方颗粒高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.4 HPLC overlay fingerprints of four batches of formula granules

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Welch Ultimate XB C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇-乙腈-0.2%磷酸水溶液（50∶20∶30，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：294 nm；柱温：30 ℃；进样量：10µL。

2.2.2 方法学考察

专属性试验：取2.1.2 项下供试品溶液、混合对照品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果辅料对含量的测定无干扰，表明方法专属性良好。

线性关系考察：取厚朴酚、和厚朴酚对照品各适量，加甲醇制成质量浓度分别为1.756，4.39，8.78，21.95，43.90 µg/ mL 的系列厚朴酚对照品溶液及2.43，6.084 6，12.169 2，30.423 0，60.846 1µg/mL的系列和厚朴酚对照品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，以质量浓度为横坐标（X，µg/mL）、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程分别为Y和=15.261X和+ 0.192 5（R² = 1.000 0，n= 5），Y厚=14.846X厚+0.796 8（R²=1.000 0，n=5）。结果表明，厚朴酚、和厚朴酚质量浓度分别在1.756 ～43.90 µg/ mL、2.43～60.846 1µg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取线性关系考察项下混合对照品溶液（和厚朴酚质量浓度为12.169 2µg/mL、厚朴酚质量浓度为8.78µg/mL），按2.2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD为0.19%和0.13%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20031152）样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液6 份，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果厚朴酚、和厚朴酚总平均含量为0.437 7 mg/g，RSD为0.11%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取重复性试验项下供试品溶液，分别于制备后放置0，3，6，9，12，18，24 h 时按2.2.1 项下色谱条件进样测定。结果厚朴酚、和厚朴酚总平均含量为1.018 9 mg/g，RSD为0.26%（n= 7），表明供试品溶液放置24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20031152，总含量为1.020 4 mg/g）0.5 g，精密称定，共6份，分别加入混合对照品溶液适量，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表4。

表4 加样回收试验结果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test（n=6）

耐用性试验：考察不同色谱柱、不同柱温、不同流速对本色谱条件的耐用性，结果见表5。

表5 含量测定耐用性试验结果Tab.5 Results of the durability test for the content determination

2.2.3 样品含量测定

取4批（批号分别为20031151，20031152，20031153，20031154）样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，计算厚朴酚、和厚朴酚的总含量。结果4 批样品中厚朴酚、和厚朴酚总含量分别为1.44，1.02，0.86，1.17 mg/g。

3 讨论

3.1 含量测定指标成分选择及样品处理方法优化

厚朴酚与和厚朴酚是中药厚朴花的主要有效成分，且药材中含量较高，是评价厚朴花药材质量的重要指标［6-9］。参照2020 年版《中国药典（一部）》中厚朴花的检测指标，选取厚朴酚、和厚朴酚作为检测指标。其他色谱条件不变的情况下，在供试品溶液的制备中，分别以甲醇、50%甲醇、乙醇为溶剂进行考察，结果以甲醇为溶剂时测得的含量最高。比较了超声和回流2 种提取方式，结果采用超声提取时测定的含量最高。

3.2 指纹图谱条件的选择［10-15］

流动相系统考察乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈- 0.1%甲酸水溶液、甲醇- 0.5%醋酸水溶液、乙腈-0.5%醋酸水溶液，结果发现，前3 个流动相系统条件下，各峰保留时间明显推后，延长了分析时间，且分离度较差；后2 个流动相系统各峰保留时间接近，均能较好分离，但乙腈- 0.5%醋酸水溶液作为流动相系统时各峰对称性更好、更尖锐，有利于指纹图谱的分析，故选择乙腈-0.5%醋酸水溶液作为流动相系统。本研究中采用二极管阵列（DAD）检测器进行紫外区全波长扫描，波长段为210～400 nm，各峰均于294 nm波长处有最大吸收，且色谱峰信息较完全，峰高较高，综合比较后选择294 nm为检测波长。

3.3 方法评价

本研究中通过理化分析，运用现代实验室方法测定厚朴花（厚朴）配方颗粒的含量并建立其指纹图谱，定量分析厚朴花（厚朴）中指标性成分的含量，通过16批标准汤剂拟合出对照指纹图谱，并与市售4批样品比较，指认了4个共有峰，且相似度均大于0.900。所建立的方法操作简便、结果准确、重复性好，结合所建立的指纹图谱，可为厚朴花（厚朴）配方颗粒的质量评价提供参考。