血清miR-144、miR-203 对胃癌根治术患者预后的评估
2023-10-17王光尧李凤东
王光尧, 李凤东
(1. 南京医科大学附属常州第二人民医院胃肠外科,常州 213000; 2.南京医科大学附属常州第二人民医院消化内科,常州 213000)
胃癌是临床最常见的恶性肿瘤之一,2018 年全球新发癌症病例1 810 万例,其中胃癌占比8.2%,我国新发45.6 万例,死亡39.0 万例[1]。基于根治性手术的多学科治疗成为胃癌的首选治疗手段,尤其对于早期患者来说,是目前可能治愈的有效手段,但术后仍存在较高的局部复发和远处转移概率,5 年累积存活率仅为30%~50%[2],因此,早期评估胃癌根治术后预后具有重要意义。研究[3]表明,肿瘤发生及发展过程中存在多种非编码基因和编码基因异常表达,微小RNA(microRNA,miR)是一种非编码小分子RNA,因其具有促癌或抑癌作用而被广泛关注。近年来,有研究[4-5]显示,miR-144、miR-203 在多种实体肿瘤组织中表达下调,参与肿瘤细胞增殖、浸润、转移、耐药等行为。也有研究[6-7]报道,胃癌组织中miR-144、miR-203 表达明显下调,可作为胃癌诊断和预后评估的生物学标记物。但血清miR-144、miR-203 是否可预测胃癌根治术后预后有待研究,本研究旨在分析血清miR-144、miR-203水平对胃癌根治术后预后的评估价值,以期为临床早期评估患者预后提供参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取南京医科大学附属常州第二人民医院(2015 年1 月至2017 年12 月)收治的113 例接受胃癌根治术治疗的胃癌患者为胃癌组,其中男性74 例,女性39 例;年龄34~76 岁,平均年龄(50.02±8.61)岁;肿瘤直径:53 例≥5 cm,60例<5 cm;TNM 分期[8]:32 例Ⅰ期,38 例Ⅱ期,43 例Ⅲ期;分化程度:21 例低分化,33 例中分化,59 例高分化;52 例淋巴结转移。纳入标准:1)经术后病理确诊;2)TNM 分期为Ⅰ~Ⅲ期,具备胃癌根治术治疗指征[9];3)患者及家属均知情;4)临床资料完整,可接受随访者;5)初次确诊,未接受任何抗肿瘤治疗者;6)年龄<80 岁。排除标准:1)合并其他部位肿瘤者;2)既往恶性肿瘤病史者;3)远处转移者;4)心、肝、肾功能严重受损者。另选取同期66 例接受内镜下切除治疗的胃息肉患者为对照组,其中男性43 例,女性23 例;年龄38~74岁,平均年龄(51.28±8.55)岁。两组性别、年龄比较,差异均无统计学意义(P 均>0.05)。本研究经常州第二人民医院伦理委员会审核批准(2021伦字128 号)。
1.2 方法
采集两组患者入院当日静脉血,3 000 r·min-1离心10 min,半径10 cm,取上清液置于-80 ℃低温冰箱中保存,Total RNA 提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司;货号:RN0401)提取血清总RNA,取5 μL 总RNA,琼脂糖凝胶电泳检测完整性,Qiagen 逆转录试剂盒(上海易汇生物科技有限公司;货号:206143)合成cDNA,加入上下游引物0.8 μL。miR-144 上游引物:5’-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3’,下游引物:5’- TGCTTATACAGTATA GATG-3’;miR-203 上游引物:5’-TCCGATGATCACCAGGAT-3’,下游引物:5’-GTGCAG GGTGCAAGGTAGC-3’;以U6 做内参校正,上游引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物:5’-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3’;上游引物:5’-TCTCGCTTCGGCAGCACA-3’。下游引物:5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’;应用实时荧光定量PCR 测定,反应条件95 ℃、30 min,95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,72 ℃、45 s,循环40 次,2-ΔΔCt法计算血清miR-144、miR-203 相对表达水平。
1.3 预后评估
所有胃癌患者均接受胃癌根治术治疗,其中48 例全胃切除术,65 例远端胃癌根治切除术,术后根据SOX 或FOLFOX 方案辅助化疗。随访3年,截至2020 年12 月,统计3 年累积存活率,定义为手术至随访截止或死亡。
1.4 统计学方法
采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析,计数资料以例(%)表示,组间比较采用χ2检验;正态分布且方差齐的计量资料以均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t 检验;Kaplan-Meier曲线绘制存活率,组间存活率Log-rank 检验;多因素Cox 回归分析胃癌根治术预后不良影响因素;ROC 曲线判断血清miR-144、miR-203 水平对胃癌根治术预后不良的评估价值,曲线下面积(area under curve,AUC)采用Z 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者血清miR-144、miR-203 水平比较
胃癌组血清miR-144、miR-203 水平分别为(0.221±0.070)、(0.343±0.063),对照组分别为(0.964±0.168)、(1.027±0.179),胃癌组血清miR-144、miR-203 水平低于对照组(t=-41.315、-36.941,P均<0.001)。
2.2 不同临床特征miR-144、miR-203 表达水平
不同性别、年龄、肿瘤直径胃癌患者血清miR-144、miR-203 水平比较,差异无统计学意义(P 均>0.05),与TNM 分期、分化程度、淋巴结转移差异有统计学意义(P 均<0.05),见表1。
表1 不同临床特征miR-144、miR-203 表达水平(±s)
表1 不同临床特征miR-144、miR-203 表达水平(±s)
临床特征nmiR-144t 值P 值miR-203t 值P 值性别男性740.214±0.066-1.4420.1520.342±0.064-0.3920.696女性390.234±0.0770.356±0.063年龄≥60 岁630.214±0.070-1.1270.2620.342±0.066-0.2110.833<60 岁500.229±0.0710.345±0.060肿瘤直径≥5 cm530.208±0.066-1.8650.0650.332±0.067-1.7410.084<5 cm600.233±0.0720.353±0.058 TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期700.236±0.0653.4070.0010.358±0.0623.743<0.001Ⅲ期430.190±0.0710.313±0.060分化程度高分化590.234±0.0732.0340.0440.356±0.0592.3440.021中低分化540.207±0.0650.329±0.065淋巴结转移有520.199±0.065-3.2680.0010.319±0.061-3.916<0.001无610.240±0.0690.363±0.058
2.3 血清miR-144、miR-203 水平与胃癌根治术后3 年累积存活率的关系
随访5~36(24.55±7.24)个月,死亡29 例,3年累积存活率为74.34%(84/113)。根据血清miR-144、miR-203 水平均值分为高、低水平组。高血清miR-144 水平组(≥0.221,n=55)死亡9例,3 年累积存活率为83.64%(46/55);低血清miR-144 水平组(<0.221,n=58)死亡20 例,3 年累积存活率为65.52%(38/58)。高血清miR-203水平组(≥0.343,n=56)死亡7 例,3 年累积存活率为87.50%(49/56);低血清miR-203 水平组(<0.343,n=57) 死亡22 例,3 年累积存活率为61.40%(35/57)。Kaplan-Meier 生存曲线显示,高血清miR-144、miR-203 水平组胃癌根治术后3年累积存活率高于低水平组(Log-rank χ2=7.795、10.083,P=0.005、0.001),见图1。
图1 不同血清miR-144、miR-203 水平与胃癌根治术后3 年累积存活率曲线
2.4 胃癌根治术预后不良影响因素的Cox 回归分析
以性别(男性=1,女性=0)、年龄(≥60 岁=1,<60 岁=0)、TNM 分期(Ⅲ期=1,Ⅱ期=0)、分化程度(高分化=1,中低分化=0)、淋巴结转移(有=1,无=0)、miR-144、miR-203 为自变量,生存时间为时间变量,预后情况(死亡=1,存活=0)为因变量,建立多因素Cox 回归模型,选择Enter 法筛选自变量。结果显示,TNM 分期Ⅲ期、淋巴结转移为胃癌根治术预后不良独立风险因素,高miR-144、miR-203 为独立保护因素(P<0.05),见表2、表3。
表2 胃癌根治术预后不良影响因素的单因素Cox 回归分析
表3 胃癌根治术预后不良影响因素的多因素Cox 回归分析
2.5 血清miR-144、miR-203 水平对胃癌根治术预后不良的评估价值
ROC 曲线结果显示,miR-144+miR-203 评估胃癌根治术预后不良的AUC 大于miR-144、miR-203 评估(Z=2.628、2.435,P=0.009、0.015),见表4、图2。
图2 血清miR-144、miR-203 水平评估胃癌根治术预后不良的ROC 曲线
表4 血清miR-144、miR-203 水平对胃癌根治术预后不良的评估价值
3 讨论
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,发生率居全球首位[1],尽管其根治性手术的多学科治疗已取得了极大进展,可根据患者的一般情况、体能状态、病理特征等选择化疗方案,但胃癌具有高度异质性,容易产生多药耐药性,导致复发和转移,严重降低了患者的预后存活率。因此,迫切需要发现可早期预测胃癌根治术不良预后的临床标记物。癌症的发生发展是多因素、多机制、多基因共同参与的复杂过程。在人类基因组中,约98%的基因序列被转录为非编码RNA,无须翻译为蛋白,在RNA 水平就可行使各自的生物学功能。miRNA 是一类内源性非编码长19~25 个核苷酸的小RNA,高度保守,可通过结合靶基因调节基因表达,降解mRNA 或阻碍其翻译,进而在转录水平上调控蛋白质表达[10]。研究表明,miRNA多位于肿瘤相关的脆性位点或基因区域,可通过调控肿瘤细胞增殖、凋亡、分化等生物学行为,影响肿瘤发展和易感性[11]。
miR-144 为红细胞发育过程中特异性高表达的miRNA 分子之一,参与红细胞表型转变,因此,既往多用于分析红细胞潜能,近年来大量研究发现,miR-144 还参与了多种恶性肿瘤进展,多呈现低表达状态[12-13]。Cheng 等[12]研究显示,结直肠癌中miR-144 表达明显减少,高表达miR-144 可通过调节白血病前转录因子3 抑制结直肠癌细胞迁移和入侵。Tao 等[13]研究显示,宫颈癌中miR-144 表达明显下调,高表达miR-144 可通过调节血管内皮生长因子A 和血管内皮生长因子C 抑制宫颈癌细胞生长和转移。本研究结果显示,胃癌患者血清miR-144 水平明显低于对照组,与TNM 分期、分化程度、淋巴结转移有关,符合miR-144 在胃癌组织中的表达情况[6],并提示低血清miR-144 水平参与了胃癌TNM 分期、分化程度、淋巴结转移变化,但其与胃癌根治术不良预后的关系尚不明确。本研究进一步分析显示,高血清miR-144 水平3 年累积存活率明显提升,为预后不良独立保护因素,说明miR-144 可能成为评估预后的生物标记物。关于miR-144 在胃癌中的抑癌机制尚不明确,肿瘤细胞的生长和增殖高度依赖糖酵解获取能量,谭业儒等[14]将miR-144 模拟物转染至胃癌细胞,荧光素酶报告系统鉴定表明,miR-144 可通过靶向抑制糖酵解和凋亡调控子抑制胃癌细胞增殖,诱导其凋亡、自噬。激活增强子结合蛋白4 具有促进胃癌迁移和侵袭的作用,Mushtaq 等[15]将miR-144 模拟物转染至HGC-27 细胞,荧光素酶报告系统鉴定表明,miR-144 能结合其3’非翻译区抑制激活增强子结合蛋白4 表达,进而抑制胃癌迁移和侵袭能力。上述研究表明,miR-144 可靶向抑制糖酵解和凋亡调控子激活增强子结合蛋白4,抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和促进凋亡,进而发挥抑癌作用。
miR-203 基因位于人染色体14q32.33,目前发现的12%的miRNA 基因位于14 号染色体,其中miRNA 密度较高,而该区域又是染色体不稳定的脆性区域,因此,容易出现杂合性丢失,导致肿瘤发生[16]。由于恶性肿瘤组织起源、所处微环境、发生发展信号转导通路不同,所参与的基因也存在差异,miR-203 就是一种在不同肿瘤中表达矛盾的miRNA。王媛等[17]研究显示,子宫内膜癌患者血清miR-203 表达显著提升,与组织学类型和生存时间相关;Huang 等[18]研究显示,非小细胞肺癌中miR-203 表达明显下调,可通过抑制SMAD3抑制非小细胞肺癌细胞迁移和入侵,说明miR-203 在不同恶性肿瘤中具有癌基因或抑癌基因作用。本研究结果显示,胃癌患者血清miR-203水平明显低于对照组,与TNM 分期、分化程度、淋巴结转移有关,提示miR-203 在胃癌中具有抑癌基因作用,符合既往研究报道[7]。进一步分析显示,高血清miR-203 水平3 年累积存活率明显提升,为预后不良独立保护因素,说明血清miR-203 可能成为评估预后的生物标记物。膜联蛋白A4 为多基因家族钙调节磷脂结合蛋白,能促进上皮向间质细胞的转化,进而促进肿瘤组织侵袭和转移,参与胃癌发生发展[19]。Li 等[20]研究发现,胃癌组织和细胞系中miR-203 表达降低与膜联蛋白A4 升高有关,生物信息学分析预测膜联蛋白A4 为miR-203 潜在靶基因,进一步荧光素酶报告基因测定证实二者关系,miR-203 模拟物转染表明miR-203 可靶向抑制膜联蛋白A4 抑制胃癌细胞增殖和上皮-间质细胞转化,抑制胃癌细胞侵袭和转移,发挥抑癌作用。ROC 曲线显示,血清miR-144、miR-203 水平均对胃癌根治术不良预后具有较好的预测价值,AUC 均>0.80,且联合评估AUC 明显提升,说明联合检测血清miR-144、miR-203 水平能更好地评估胃癌根治术的不良预后,指导为患者制订方案。
综上所述,胃癌患者血清miR-144、miR-203水平明显下调,为胃癌根治术不良预后独立保护因素,联合检测可提升不良预后评估价值。本研究局限性在于为单中心研究,同时胃癌根治术患者预后影响因素较多,未全部纳入分析,此外,有关miR-144、miR-203 在胃癌根治术中不良预后的作用机制还有待进一步研究。