黑木耳黑色素对缺铁性贫血诱导溃疡性结肠炎小鼠的保护作用

王雨亭，王 淼，李元敬，施树良，雷 虹,*，冯 磊*

（1.黑龙江大学生命科学学院，农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江省寒地生态修复与资源利用重点实验室，黑龙江省普通高校分子生物学重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080；2.华南师范大学材料与新能源学院，广东 汕尾 516600；3.哈尔滨工业大学生命科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨 150001；4.黑龙江省林业科学院科研处，黑龙江 哈尔滨 150081）

缺铁性贫血（iron deficiency anemia，IDA）严重影响机体健康，可导致结肠组织中黏膜溃疡、氧化应激增加和炎性细胞浸润[1]，产生过多且具有强氧化活性的自由基，引起细胞膜、DNA分子碱基修饰等多种氧化损伤，从而导致溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）甚至更严重的结肠癌发生[2]。诱导UC疾病的临床症状多表现为体质量下降、腹泻、便血等情况[3]。目前，对于炎症性肠病的治疗多采用氨基水杨酸等药剂，但长期服用副作用较大[4]。一些天然产物具有极佳的抗氧化、抗炎效果，有研究表明，天然产物15,16-二氢丹参酮I可通过改善氧化应激能力及抗炎活性等改善UC[5]。苦石莲提取物具有一定的抗炎等生物活性[6]。综上，天然产物可能是一种改善IDA诱导UC潜在的安全有效新药物。

黑木耳是一种在我国分布极为广泛且具有独特营养价值与保健功能的食用菌[7]，被证实具有免疫调节、抗氧化等作用[8-9]，根据本课题组的前期研究，从黑木耳中提取的黑色素以吡咯环和吲哚环为骨架，骨架上连接着脂肪碳链和羰基，大量聚合后形成不规则的单体，且在207 nm波长处有强吸收峰，由元素组成结果可以得到黑木耳黑色素中真黑色素与棕黑色素的含量比为10.36∶1.00[10]，与球状蜣螂壳黑色素结构[11]基本一致，说明天然黑色素结构具有较高的相似性。黑色素作为黑木耳的主要天然产物之一，具有清除自由基、抗炎、抗氧化、抗病毒及增强免疫力等多种生物功效[12-14]。研究表明，墨鱼黑色素可以改善机体炎症浸润、清除自由基并改善氧化应激损伤，最终减缓UC的发生[15]，本课题组前期实验结果表明，IDA可导致肠道损伤，而黑木耳黑色素可改善IDA小鼠的贫血症状，并修复肠道损伤[16-17]，然而黑木耳黑色素对IDA诱导的小鼠UC保护作用机制尚不清楚。

许多天然产物具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等特性[18]，且可通过调控Toll样受体4（Toll-like receptors 4，T L R 4）/核转录因子-κ B（n u c l e a r f a c t o rk a p p a B，N F-κ B）信号通路来抑制炎症发生[19]，但有关利用天然产物黑木耳黑色素治疗UC的研究相对较少，因此，本研究通过IDA诱导UC小鼠模型，探究灌胃黑木耳黑色素对UC小鼠氧化应激反应及TLR4/NF-κB信号通路的调控作用，以期为黑木耳黑色素功能性产品的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级昆明种雄性小鼠，购自哈尔滨医科大学实验动物学部，生产许可证号：SCXK（黑）2019-001。

黑木耳购自东宁黑木耳产业基地（菌种保藏号：CCTCC-HDX）。

浓盐酸 哈尔滨理工化学试剂有限公司；氢氧化钠天津市大陆化学试剂厂；氯仿、异丙醇 天津市科密欧化学试剂有限公司；乙酸乙酯、无水乙醇 天津市富宇精细化工有限公司。以上试剂均为分析纯。

总抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）检测试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒、羟自由基（·OH）检测试剂盒、小鼠超氧阴离子自由基（O2-·）检测试剂盒 南京建成生物工程研究所；TRIzol、反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒 江苏康为世纪生物科技股份有限公司；粪便隐血定性检测试剂盒 上海尚宝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

JE3002型电子分析天平 上海浦春计量仪器有限公司；BCM-1000A型生物洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；H2050R型台式高速离心机 美国Thermo Sorvall公司；Elx800uv型酶标仪 美国Gene公司；NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计 美国Thermo Scientific公司；QuantStudioTH1型荧光定量PCR仪 哈尔滨覆霜科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳黑色素的制备

参考Zou Yu等[20]的实验方法，黑木耳粉碎后过80 目筛，取25 g黑木耳粉末于500 mL 3 mol/L盐酸中，70 ℃下水浴搅拌浸提1.0～1.5 h后加入15.6 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至12，4 000 r/min离心10 min。上清液用12 mol/L盐酸调节pH值至2，4 000 r/min离心20 min，沉淀即为黑色素粗品。粗品通过氯仿、乙酸乙酯和乙醇试剂依次洗涤两次，去离子水洗涤5～7 次，所得固体冷冻干燥得到纯化的黑色素[21]，实验室前期采用原子吸收法测定黑木耳黑色素中铁元素的含量为（2.03±0.49）mg/kg[17]。

1.3.2 低铁饲料的配制

参照AIN-93G标准配方，委托北京科澳协力饲料有限公司加工低铁饲料，成分如表1所示，加工配制的饲料由北京谱尼测试集团采用电感耦合等离子体发射光谱（inductively coupled plasma atomic emission spectrometer，ICP-AES）测得其含铁量为4.98 mg/kg，符合低铁饲料要求（＜5 mg/kg），普通饲料含铁量为116.12 mg/kg[22]。

表1 动物低铁饲料成分Table 1 Ingredients of low-iron diet

1.3.3 实验动物分组及模型建立

根据《保健食品检验与评价技术规范实施手册》中的具体操作方法[23]，选取24 日龄昆明种雄性小鼠，随机分为3 组，每组15 只，分别为空白对照组、模型组、黑木耳黑色素组。适应性喂养1 周后开始实验，空白对照组小鼠整个实验周期始终饲喂正常饲料，自由饮用双蒸水。模型组、黑木耳黑色素组小鼠饲喂低铁饲料，自由饮用去离子水，造模时间为2 周。实验治疗期，黑木耳黑色素组小鼠持续3 周进行黑色素灌胃处理；模型组小鼠喂养方式与造模期间相同。为避免外源铁污染，实验采用塑料笼体和非铁质笼盖。自实验开始，每7 d称一次体质量。

实验动物饲养：动物实验室所有的设施条件与管理任务均依照《中华人民共和国卫生部实验动物环境及设施标准》进行，温度（20±2）℃、相对湿度45%～65%，自动控制系统进行12 h的日夜光照更替。

1.3.4 全血血液指标检测

对小鼠眼球进行采血，将40 μL血液加入至360 μL肝素钠生理盐水中，利用血细胞自动分析仪检测并记录血红蛋白（hemoglobin，Hb）、红细胞（red blood cell，RBC）、白细胞（white blood cell，WBC）水平。

1.3.5 疾病活动指数评分

记录各组小鼠体质量变化率，观察大便性状及大便隐血等情况，参照Murthy等[24]的评分系统进行疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分，粪便性状分为3 个等级：正常、松散和稀便。小鼠正常粪便成型，为颗粒状；若粪便黏度增加且易散，但不黏附于肛门，则为松散；若粪便不成形或呈稀水样，且黏附于肛门，则为稀便；利用粪便隐血定性检测试剂盒检测粪便隐血阳性，若粪便中加入试剂后出现蓝色，则为隐血阳性；若粪便肉眼可见有红褐色或鲜红色血液，则为肉眼血便。具体评分标准见表2。按公式（1）计算DAI评分。

表2 DAI评分标准Table 2 Disease activity index (DAI) scoring criteria

1.3.6 器官指数测定

将小鼠处死后，对小鼠肝脏、脾脏、心脏进行快速分离及称质量，按公式（2）计算器官指数[25]。

1.3.7 组织病理学分析

快速解剖小鼠后，将结肠组织经甲醛固定，制备成石蜡块，切片，经苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后在显微镜下观察结肠组织损伤变化。通过判断炎性细胞浸润、上皮损伤、隐窝丢失的程度对炎症程度进行鉴定[26]。参考朱磊等[27]的方法进行组织病理学评分，具体评分标准见表3。

表3 结肠组织病理学评分标准Table 3 Colonic histological evaluation criteria

1.3.8 氧化应激生物标志物水平测定

分离小鼠结肠，保存在-80 ℃条件下，用相应试剂盒测定TAC、MDA、SOD、·OH、O2-·的水平。

1.3.9 荧光定量PCR检测炎症因子及相关基因相对表达量

利用T R I z o l 试剂提取结肠组织总R N A。使用HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit合成cDNA。使用2×Realstar Green Fast Mixture with ROX II进行荧光定量PCR。扩增条件为：预变性温度95 ℃，2 min；变性温度95 ℃，15 s；退火温度60 ℃，15 s；延伸温度72 ℃，30 s，40 次循环。相对mRNA水平归一化为内源性控制基因β-Actin。采用比较阈值循环（Ct）法分析基因的相对表达量。本实验使用引物如表4所示。

表4 TLR4、NF-κB-p65、TNF-α、IL-10的mRNA引物序列及片段长度Table 4 mRNA primer sequences and fragment lengths of TLR4,NF-κB-p65, TNF-α, and IL-10

1.4 数据处理与分析

应用Graphpad Prism 9软件对数据进行分析处理并作图。样本平均值采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用最小显著性差异法（least significant difference，LSD）检验。P＜0.05表明数据具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 黑木耳黑色素对IDA诱导的UC小鼠血液指标的影响

临床贫血症状可通过血液中的Hb、RBC、WBC等水平来诊断[28]。如图1A、B所示，与空白对照组相比，模型组小鼠Hb质量浓度、RBC数均显著降低（P＜0.000 1，P＜0.01），灌胃黑木耳黑色素3 周后，Hb质量浓度、RBC数显著提高（P＜0.000 1，P＜0.01），且与空白对照组无显著差异（P＞0.05），表明黑木耳黑色素具有改善机体贫血的功效。与空白对照组相比，模型组小鼠WBC数显著下降（P＜0.000 1），黑木耳黑色素干预组小鼠的WBC数显著恢复（P＜0.000 1）（图1C），表明缺铁引起的IDA小鼠可能存在摄入营养不均衡，导致WBC数偏低，说明免疫系统的能力降低，易引发结肠炎症[29]，研究表明，IDA小鼠常伴随着肠道损伤[16]，灌胃黑木耳黑色素后小鼠WBC数恢复正常，说明加入黑色素可有效提高IDA小鼠的免疫能力，缓解结肠炎症。

图1 黑木耳黑色素对IDA诱导的UC小鼠血液中Hb（A）、RBC（B）和WBC（C）水平的影响Fig.1 Effect of Auricularia auricula melanin on hemoglobin (A), red blood cell (B) and white blood cell (C) levels in blood of IDA-induced UC mice

2.2 黑木耳黑色素对IDA诱导的UC小鼠体质量变化及DAI评分的影响

在实验过程中，空白对照组小鼠行动活跃、毛发光亮整洁；模型组小鼠出现了行动缓慢、活动力下降等现象，但给药后小鼠在反应、行动等方面均有改善。由图2A可知，实验结束时，与模型组相比，给药后的小鼠体质量显著增加（P＜0.001），且与空白对照组小鼠相比无显著差异（P＞0.05），结果表明，影响小鼠体质量生长的因素可能与机体结肠损伤影响食物的消化吸收有关[30]，黑木耳黑色素可使小鼠胃肠消化吸收功能逐渐恢复，从而使结肠受损的模型小鼠体质量恢复至正常水平。

图2 黑木耳黑色素对IDA诱导的UC小鼠体质量（A）及DAI评分（B）的影响Fig.2 Effect of Auricularia auricula melanin on body mass (A) and DAI score (B) in IDA-induced UC mice

DAI评分可用来评判结肠炎症的损伤程度，DAI评分越高，说明疾病越严重[31]，UC能引起小鼠体质量增长缓慢、粪便特征异常及伴随便血等症状[32]。相关研究发现，天然产物芍药提取物可明显降低结肠炎小鼠的DAI评分，并使粪便性状得到改善[33]，在本研究中，黑木耳黑色素也有相同的治疗效果。由图2B可知，模型组小鼠与空白对照组小鼠相比DAI评分显著升高（P＜0.000 1），黑木耳黑色素干预后DAI评分显著降低，且与空白对照组小鼠相比无显著差异（P＞0.05），结果表明黑木耳黑色素可显著恢复小鼠DAI评分，对由IDA诱导UC所表现的体质量增长缓慢、粪便稀散、便血等症状具有极佳的改善效果。

2.3 黑木耳黑色素对IDA诱导的UC小鼠免疫器官指数的影响

脾脏是外周免疫器官，免疫细胞会在成熟的脾脏中定植并对抗原作出反应。胸腺是中枢免疫器官，胸腺的主要功能是产生T淋巴细胞。因此，脾脏和胸腺指数可反映机体先天免疫功能的强弱[34-35]。如图3 所示，与空白对照组相比，模型组小鼠胸腺指数显著降低（P＜0.000 1），脾脏指数显著升高（P＜0.000 1），经黑木耳黑色素灌胃给药后，各指数恢复至空白对照组水平（P＞0.05），因此黑木耳黑色素对UC小鼠的免疫器官指数具有调节作用。

图3 黑木耳黑色素对IDA诱导的UC小鼠胸腺指数（A）及脾脏指数（B）的影响Fig.3 Effect of Auricularia auricula melanin on thymus index (A) and spleen index (B) of IDA-induced UC mice

2.4 黑木耳黑色素对IDA诱导UC小鼠结肠组织病理学及病理学评分的影响

如图4所示，空白对照组小鼠结肠上皮细胞排列紧密有序，有大量结构良好的隐窝和绒毛，隐窝和绒毛长而清晰，无溃疡及炎症细胞的浸润。而模型组小鼠肠道组织结构受损，隐窝结构和杯状细胞扭曲，结肠黏膜溃烂，上黏膜及屏障变形，黏膜下层炎症细胞严重浸润。有研究表明，UC对小鼠结肠组织造成严重破坏，导致结肠充血、健康组织受到损伤、大量上皮细胞凋亡[36]，本实验中模型组小鼠的结肠组织病理学分析与此情况较为一致，与空白对照组相比，病理学评分显著升高（P＜0.000 1），黑木耳黑色素给药治疗后可显著改善肠道组织损伤情况，隐窝结构基本恢复正常，使肠黏膜溃疡和隐窝破坏程度均有所减轻，炎症细胞浸润基本消失，病理学评分明显下降，与空白对照组无显著性差异（P＞0.05），表明黑木耳黑色素在维持结肠结构完整及改善炎症等方面有着极佳的效果，同时有相关研究报道，天然产物蒲公英的提取物可修复溃疡性结肠损伤[37]，与本研究中的黑木耳黑色素效果相似，提示黑木耳黑色素有助于IDA诱导UC小鼠肠道恢复正常。

图4 小鼠结肠组织病理学HE染色及组织病理学评分Fig.4 Hematoxylin-eosin staining and histopathological scores of colon tissues in mice

2.5 黑木耳黑色素对IDA诱导的UC小鼠结肠氧化应激损伤的影响

氧化应激与氧化细胞损伤是结肠炎的主要标志之一[38]，其中TAC与SOD活力是反映抗氧化能力的重要指标[39]；MDA含量及·OH、O2-·水平可反映氧化应激损伤程度[40-41]。如图5所示，与空白对照组相比，模型组小鼠结肠组织中TAC与SOD活力显著下降（P＜0.000 1），MDA、·OH、O2-·水平显著上升（P＜0.000 1、P＜0.01），而黑木耳黑色素组与空白对照组相比无显著差异（P＞0.05）。说明黑木耳黑色素能调节IDA诱导的UC小鼠体内氧化应激水平，与前人对其他天然产物研究的结果[42-45]一致，说明黑木耳黑色素能有效恢复IDA诱导的UC小鼠总抗氧化能力及结肠中SOD抗氧化酶活性，并能有效改善疾病小鼠脂质过氧化损伤，同时调节结肠中氧自由基的异常表达。

图5 黑木耳黑色素对IDA诱导的UC小鼠结肠中TAC（A）、SOD活力（B）、MDA含量（C）及·OH（D）、O2－·（E）水平的影响Fig.5 Effect of Auricularia auricula melanin on the levels of TAC (A),SOD (B), MDA (C), ·OH (D), and O2－· (E) in colon tissues of IDA-induced UC mice

2.6 黑木耳黑色素对TLR4/NF-κB信号通路调控的影响

T L R 4/N F-κB是导致肠道免疫炎症反应的重要细胞间信号通路[46]，越来越多的研究显示，TLR4/NF-κB介导的信号转导通路在炎症性疾病发生发展中具有重要作用，可通过激活NF-κB与TLR4结合产生大量TNF-α及其他炎症因子[47]。炎症因子水平是评估炎症性疾病的重点指标之一[48]，促炎细胞因子TNF-α的过表达在一定程度上会加重肠道损伤，导致肠道炎症发生[49]。抗炎因子IL-10在维持肠道黏膜免疫调节中发挥重要作用，可以拮抗炎症因子的产生，并保持肠黏膜屏障完整，进而减轻炎症性肠病的进展。增强IL-10在体内的表达或者补充IL-10均可以预防肠炎发生[50]。如图6所示，与空白对照组相比，模型组小鼠结肠组织中TLR4、NF-κB-p65mRNA表达量显著上升（P＜0.001、P＜0.000 1），黑木耳黑色素干预后表达量均下降至与空白对照组无显著性差异（P＞0.05）。相应地，给药治疗后促炎因子TNF-αmRNA表达水平显著降低（P＜0.01），抗炎因子IL-10 mRNA表达量显著增加（P＜0.05），表明黑木耳黑色素通过调控TLR4/NF-κB信号通路，有效逆转炎症细胞因子异常表达，从而缓解IDA诱导的UC小鼠炎症反应，恢复防御功能。该结果与钟继红等[51]的实验结果相似。

图6 黑木耳黑色对信号通路中相关基因TLR4（A）、NF-κB-p65（B）、TNF-α（C）、IL-10（D）表达水平的影响Fig.6 Effect of A. auricula melanin on the expression levels of TLR4 (A),NF-κB-p65 (B), TNF-α (C) and IL-10 (D)

3 结 论

黑木耳黑色素在UC小鼠肠道中表现出显著的抗氧化、抗炎功能。黑木耳黑色素可通过增强机体抗氧化酶活力、降低氧化应激损伤、调控TLR4/NF-κB信号通路中相关基因表达，保护肠黏膜，从而减轻结肠炎症的病理程度。以上结果表明，从天然物质中提取黑色素可以作为治疗UC功能食品或营养药品的有效成分，本研究可为其药物开发提供理论参考。