甜瓜蒂抗氧化、降糖活性及化学成分分析的研究

李 菡, 张光财, 赵艳霞, 张欣雨

(1.陕西科技大学 食品科学与工程学院(生物与医药学院), 陕西 西安 710021; 2.山东省食品药品检验研究院, 山东 济南 250000)

0 引言

甜瓜蒂(PedicellusMelo)是我国传统中药材,取自于葫芦科植物甜瓜(CucumismeloL)的干燥果柄,别名瓜蒂、瓜丁、苦丁香、甜瓜把[1],在中医古籍中记录其具有多种治疗疗效,如《神农本草经》中记载其“主治大水,身面四肢浮肿……病在胸腹中,皆吐下之”,《金匮要略》中有“瓜蒂汤,治诸黄”,《千金翼方》中记载其“治热病发黄”;《名医别录》中称其“去鼻中息肉,疗黄疸”等[2].目前临床上主要用于催吐和湿热退黄治疗,如将其研磨成细粉再经鼻粘膜给药或制成片剂口服给药用于治疗黄疸[3].将甜瓜蒂提取物进行体外抗肿瘤实验,结果表明其对肿瘤细胞有显著的抑制作用[4,5].自上世纪50年代在甜瓜蒂中发现葫芦素成分以来,甜瓜蒂受到越来越多的关注.现代药学研究证实葫芦素类化合物是甜瓜蒂的主要活性物质,包括葫芦素B、D、E,异葫芦素B等,具有良好的抗炎、抗肿瘤活性、抗环境化学致癌物作用等药理活性[6-9].甜瓜蒂药用历史悠久,目前关于甜瓜蒂中葫芦素成分的提取纯化和药理学研究较多,但对其他活性成分以及药理学机制探讨较少,对甜瓜蒂提取物的分析缺乏.

非胰岛素依赖型糖尿病患者占90%以上,由于胰岛素分泌和(或)胰岛素作用缺陷以及蛋白质和脂质代谢紊乱,常出现餐后血糖持续升高症状[10,11].持续性高血糖又会导致出现肾病、心血管疾病等并发症[12],有效控制餐后高血糖是预防糖尿病、减少并发症以及降低死亡率的重要措施之一.α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是引起餐后血糖升高的主要酶之一,抑制其活性已成为控制餐后高血糖的主要治疗策略.此外,自由基是人体组织中许多生化反应的中间代谢产物,在体内堆积会导致细胞膜破坏,加速细胞衰老,导致恶性肿瘤、原发性高血压、衰老、糖尿病等疾病[13,14].从天然产物中寻找活性组分,成为抗衰、降糖、降脂等功能性食品或药物研究的热点.本实验考察了甜瓜蒂提取物的化学成分,对提取物和萃取物进行体外抗氧化和降糖活性研究,为甜瓜蒂在食品、医药等领域的进一步深入研究与利用提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜瓜蒂,购自安徽毫州药材市场,经鉴定为葫芦科植物甜瓜的干燥果蒂.将甜瓜蒂表面去除杂质,50 ℃鼓风干燥 6 h,然后粉碎过 40 目筛,放入自封袋中备用.

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):上海源叶生物科技公司;抗坏血酸、邻苯三酚、阿卡波糖、水杨酸、硫酸亚铁:天津市天力化学试剂有限公司;铁氰化钾、三氯乙酸、碳酸钠:天津市科密欧化学试剂有限公司;Tris-HCl:北京博奥拓达科技有限公司;α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside,PNPG):购自于上海泰坦科技股份有限公司;无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等均为分析纯.

1.2 仪器与设备

电热恒温鼓风干燥箱(GZX-GF101-2-BS-Ⅱ/H),上海跃进医疗器械有限公司;电子天平(JA2603B),上海天美天平仪器有限公司;多功能粉碎机(BJ-500A),德清拜杰电器有限公司;数显恒温水浴锅(HH-4),金坛市江南仪器厂;台式高速离心机(TG16-WS),湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;紫外可见分光光度计(UV-5100),上海元析仪器有限公司;全波长扫描式多功能读数仪(varioskan flash),Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪( Fisher Scientific),Heraeus Fresco 17离心机( Fisher Scientific),Ultimate 3000超高效液相色谱系统(Dionex),赛默飞世尔科技有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

参照乙醇回流提取法[15]并做修改:称取甜瓜蒂粉末150 g,加入 10 倍体积的75%乙醇浸泡12 h,提取温度为80 ℃,提取时间1.5 h,重复操作3次,合并滤液,减压浓缩得到总提取物,干燥,称重,备用.将总提取物用50 mL蒸馏水重溶,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取,每种溶剂萃取3次,每次1.5 h,减压浓缩得到石油醚组分,乙酸乙酯组分、正丁醇组分、水相组分,干燥,称重,备用.按照公式(1)计算总提取物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相五个组分得率:

(1)

1.3.2 UHPLC-Q-Exactive MS 分析

(1)色谱条件

采用ACQUITY UPLC BEH C18 column (100 mm*2.1 mm,1.7 μm, Waters,USA)进行色谱分离,色谱柱柱温为40 ℃,流速为0.3 mL/min,其中A 流动相为水和0.1%甲酸,B 流动相为乙腈.对代谢物采用以下梯度进行洗脱:0～0.5 min,5%B;0.5～1.0 min,5%B;1.0～9.0 min,5%～100%B; 9.0～12.0 min,100%B;12.0～15.0 min,5%B.每个样本的上样体积为5 μL.整个分析过程中样品置于4 ℃自动进样器中.为避免仪器检测信号波动而造成的影响,采用随机顺序进行样本的连续分析.样本队列每组样品后插入QC样品,用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性.

(2)Q-EXACTIVE 质谱条件

分别采用电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式进行检测.样品经UHPLC分离后用Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific)进行质谱分析.HILIC 色谱分离后的ESI源条件如下:Ion Source Gas1(Gas1):60,Ion Source Gas2(Gas2):60,Curtain gas (CUR):30,source temperature:320 ℃,IonSapary Voltage Floating (ISVF)±3500 V(正负两种模式);MS scan m/z range:80～1200 Da,product ion scan resolution:17500, MS scan accumulation time 0.20 s/spectra,product ion scan accumulation time 0.05 s/spectra;二级质谱采用information dependent acquisition (IDA)获得,并且采用high sensitivity 模式,Declustering potential(DP):±60 V(正负两种模式),Collision Energy :35±15 eV,IDA设置如下 Exclude isotopes within 4 Da,Candidate ions to monitor per cycle:6.

(3) 数据处理

将质谱采集得到的原始数据经过Compound Discoverer 3.0(Thermo Fisher Scientific)软件进行峰提取、峰对齐、峰校正、标准化等数据前处理.输出由样本名称、谱峰信息(包括保留时间和分子量)、及峰面积组成的三维数据矩阵.代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配(<25 ppm)和二级谱图匹配的方式,检索实验室自建数据库以及Bio cyc、HMDB、metlin,HFMDB、Lipidmaps等数据库.

(4)KEGG 通路富集分析

对关键靶点蛋白进行基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析,分析均根据P<0.05 表示具有统计学意义.

1.3.3 抗氧化能力测定

(1)DPPH 自由基清除能力测定

参照庄远杯等[16]方法并稍作修改,试管中加入样品溶液0.2 mL,接着加入0.2 mL DPPH-乙醇溶液(0.2 mmol/L),涡旋仪混匀,暗处放置30 min,517 nm处测定OD值记为A1.用无水乙醇代替DPPH-乙醇溶液,测定OD值记为A2,并测定0.2 mL DPPH-乙醇溶液和0.2 mL无水乙醇混合液的OD值记为A0.以无水乙醇为参比,以抗坏血酸作为对照,DPPH自由基清除率按公式(2)计算:

DPPH 自由基清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×100

(2)

(2)·OH清除能力测定

参照孙颖等[17]测定羟自由基的清除能力,试管中加入样品溶液0.1 mL,再依次加入0.1 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液,0.1 mL 6 mmol/L的过氧化氢溶液,1 mL 6 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液,37 ℃水浴1 h,在510 nm处测定OD值记为A1.用蒸馏水代替样品溶液测定OD值记为A0,用蒸馏水代替H2O2溶液测定OD值记为 A2,以抗坏血酸作为阳性对照,按照公式(3)计算·OH 清除率:

·OH自由基清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×10

(3)

(4)

(4)总还原力测定

参考张君萍等[19]的方法,准确吸取 0.1 mL 样品溶液置于试管中,依次加入0.25 mL磷酸盐缓冲溶液(pH6.6,0.2 mol/L)和0.25 mL 1%铁氰化钾溶液,50 ℃水浴20 min,然后加入0.25 mL 10%三氯乙酸溶液终止反应.3 000 r/min离心10 min,取上清液0.25 mL,加0.25 mL无水乙醇和0.05 mL 0.1% FeCl3溶液,涡旋仪振荡,700 nm处测定OD值,平行测定3次,以抗坏血酸作为对照.OD值越大说明样品的总还原力越强.

1.3.4 降糖能力测定[20]

(1) α-葡萄糖苷酶抑制率测定

将磷酸盐缓冲液配制成0.1 mol/L pH=6.8,取适量 PNPG溶于磷酸盐缓冲液中配制成10 mmol/L,α-葡萄糖苷酶配置为10 U/mL,将上述溶液保存在适宜的条件下.配制0.312 5 mg/mL、0.625 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL 6个浓度的提取物和阿卡波糖样品,阳性对照为阿卡波糖.在96孔板中加入不同样品溶液10 μL,40 μL的α-葡萄糖苷酶溶液,混匀后37 ℃恒温水浴15 min,结束后加入50 μL的PNPG溶液,水浴反应30 min,结束后加入100 μLNa2CO3终止反应,在405 nm处测其吸光值(A样品).空白参比用蒸馏水代替样品(A空白),对照以PBS代替α-葡萄糖苷酶(A对照),阳性对照为阿卡波糖,按照公式(5)计算抑制率:

抑制率(%)=1-(A样品-A对照)/A空白×100

(5)

(2) α-淀粉酶抑制率的测定

配制0.312 5 mg/mL、0.625 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL 6个浓度的样品溶液,阳性对照为阿卡波糖且与样品溶液同浓度.取1 mL的样品溶液,1 mL的α-淀粉酶溶液,混匀后在37 ℃水浴中反应30 min,后加入2 mL 1%的淀粉酶溶液,于37 ℃反应10 min后加入2 mL的DNS试剂,沸水浴5 min后,待其冷却后,在540 nm处测其吸光值(A样品).空白参比用磷酸盐缓冲液代替样品(A空白),对照以PBS代替α-淀粉酶(A对照),阳性对照为阿卡波糖,按照公式(6)计算抑制率:

抑制率(%)=1-(A样品-A对照)/A空白×100

(6)

2 结果与讨论

2.1 样品组分得率

表1结果显示,以150 g甜瓜蒂粉末进行回流提取,提取物得率为38.72%,再将提取物进行萃取,得到的各组分的质量从大到小依次为水相、正丁醇相、石油醚相和乙酸乙酯相.

表1 样品组分得率

2.2 UHPLC-Q-Exactive MS结果分析

2.2.1 分析鉴定结果

以甜瓜蒂总提取物为检测对象(n=3),对UHPLC-Q-Exactive MS的数据结果进行分析,鉴定出35个单体化合物,主要以氨基酸、有机酸和萜类化合物为主,将推测出的化合物名称、保留时间、化学式等列举出来,具体如表2所示.

表2 甜瓜蒂总提取物成分汇总表

2.2.2 KEGG通路分析

为了进一步分析候选靶点的可能作用,将得到的代谢物提交到KEGG网站,进行相关通路分析.如图1所示,谢物主要富集在β-丙氨酸代谢,α-亚麻酸代谢,莨菪烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成,嘧啶代谢,嘌呤代谢,苯丙烷生物合成,泛酸和辅酶A生物合成,油菜素类固醇生物合成,ABC转运蛋白和其他代谢途径10条特定途径.

图1 KEGG通路富集分析气泡图

图2为KEGG通路富集分析柱状图.由图2可以更清楚地看出,ABC转运蛋白,α-亚麻酸代谢,嘌呤代谢,β-丙氨酸代谢4条途径均显示出较低的P值(P<0.01),说明这四条途径显著性差异明显,其中ABC转运蛋白的显著性最为明显.

图2 KEGG通路富集分析柱状图

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH 自由基清除能力

如表3和图3所示,样品浓度为0.1 mg/mL～1.0 mg/mL 时,随着样品浓度的升高,甜瓜蒂提取物及其萃取物对 DPPH 自由基的清除率不断地升高.经计算,甜瓜蒂总提取物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相对 DPPH 自由基清除能力的IC50值分别为 0.644 9 mg/mL、3.504 mg/mL、0.704 2 mg/mL、0.234 8 mg/mL、0.519 1 mg/mL.说明甜瓜蒂提取物及其萃取物对DPPH 自由基有很强的清除能力,且正丁醇萃取物活性最好.

图3 甜瓜蒂提取物及其不同极性部位对DPPH自由基清除率

表3 甜瓜蒂提取物及其不同极性部位对DPPH自由基清除效果

2.3.2 ·OH清除能力

如表4和图4所示,浓度为 0.1 mg/mL～1.0 mg/mL时,甜瓜蒂提取物及其萃取相对·OH的清除率呈剂量依赖性升高,趋势明显.浓度为1.0 mg/mL时,抗坏血酸的·OH清除率为98.86%,五个组分的·OH清除率均在50%以上,效果最好的正丁醇萃取相的·OH清除率甚至达到了69.4%,说明甜瓜蒂提取物及其不同极性部位对·OH有很强的清除能力,且正丁醇萃取相的清除能力最强.

图4 甜瓜蒂提取物及其不同极性部位对·OH自由基清除率

表4 甜瓜蒂提取物及其不同极性部位对·OH自由基清除效果

图5 甜瓜蒂提取物及其不同极性部位对自由基清除率

表5 甜瓜蒂提取物及其不同极性部位对自由基清除效果

2.3.4 总还原力

如图6所示,甜瓜蒂总提取物、水相、石油醚相和乙酸乙酯相总还原力趋近直线,但正丁醇相仍呈现出浓度依赖性趋势,表明甜瓜蒂正丁醇萃取物具有总还原能力.

图6 甜瓜蒂提取物及其不同极性部位总还原力

2.4 降糖活性

2.4.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性

α-葡萄糖苷酶是生物体糖代谢途径中不可或缺的一种糖苷水解酶,可以通过抑制其活性来减少葡萄糖的生成和吸收,从而使机体胰腺水平保持正常.对甜瓜蒂提取物及其萃取物进行体外实验,其结果如图7所示.当样品浓度在0.312 5～10 mg/mL时,各组分对α-葡萄糖苷酶抑制率随浓度的增大而增加,甜瓜蒂总提取物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相的IC50值分别为150.1 mg/mL、12.17 mg/mL、218.4 mg/mL、47.63 mg/mL、37.7 mg/mL,由此可见石油醚相对α-葡萄糖苷酶抑制效果最好.

图7 甜瓜蒂提取物及其不同极性部位α-葡萄糖苷酶抑制率

2.4.2 α-淀粉酶抑制活性

α-淀粉酶可以水解淀粉分子链中的α-1,4-葡萄糖苷键,将淀粉链切断成为短链糊精、寡糖和少量麦芽糖和葡萄糖,通过抑制此酶的活性从而降低血糖和血脂水平.如图8所示,甜瓜蒂提取物及其萃取物对α-淀粉酶抑制作用呈剂量依赖性,当浓度达到10 mg/mL时,阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制率为97.54%,总提取物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相五个组分的抑制率分别为69.35%、75%、71.06%、72.23%、63.38%.

图8 甜瓜蒂提取物及其不同极性部位α-淀粉酶抑制率

经计算,这五个组分的IC50值分别为3.012 mg/mL、1.452 mg/mL、1.839 mg/mL、4.167 mg/mL、1.493 mg/mL,可知在同条件下石油醚相萃取物对α-淀粉酶抑制率相对较好,数据表明甜瓜蒂提取物及其萃取物对α-淀粉酶有一定的抑制效果.

3 结论

来源于天然植物的活性药物因其具有资源丰富、低毒高效、作用广谱等优势,近年来已经发展成为糖尿病治疗研究的热点领域,并且展现出良好的研究结果和应用前景.本研究通过乙醇回流提取法制备传统中药甜瓜蒂提取物,再采用不同极性的有机溶剂进行萃取,最终获得甜瓜蒂总提取物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相五个组分.

对甜瓜蒂总提取物进行UHPLC-Q-Exactive MS成分分析,共分析得到35个单体化合物,主要为氨基酸、有机酸和萜类等化合物.将分析得到的代谢物进行KEGG通路分析,共得到10条显著的代谢途径,其中ABC转运蛋白的显著性最为明显.

对五个组分进行体外抗氧化和降糖活性研究.体外抗氧化实验表明:在浓度0.1～1.0 mg/mL时,甜瓜蒂提取物及其不同极性部位呈浓度依赖性,正丁醇相具有较强的还原能力,对 DPPH 自由基、羟基自由基、超氧阴离子清除能力的IC50值分别为0.234 8±0.053 mg/mL、0.148 5±0.027 mg/mL、0.037±0.007 mg/mL,体外抗氧化活性效果显著.

同时,五个组分表现出较好的体外降糖活性,其中石油醚相体外降糖效果最为明显,对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制能力的IC50值分别为12.17±0.205 mg/mL、1.452±0.082 mg/mL,抑制效果仅次于阳性药物阿卡波糖.

实验数据表明甜瓜蒂提取物及其不同极性部位具有良好的体外抗氧化和降糖活性,尤其是正丁醇相和石油醚相,分别表现出较强的抗氧化和降糖能力,但这两个萃取物成分尚不明确,且此次研究均为体外实验,甜瓜蒂萃取物成分分析以及动物体内活性的验证,这些内容有待进一步的研究.