中国市售食品接触硅胶制品的细胞毒性评价

郭一凡，张京伟，范晓洁，王文娟，封棣

中国市售食品接触硅胶制品的细胞毒性评价

郭一凡，张京伟，范晓洁，王文娟，封棣*

（北京工商大学 轻工科学技术学院，北京 100048）

为了研究不同细胞毒性测试方法之间的差别，本研究利用不同体外细胞毒性评价测试体系下的食品接触硅胶制品（Food Contact Silicone Products, FCSPs）的整体安全性进行研究。样品在体积分数为95%的乙醇中模拟迁移（70℃保持2 h）后，通过系统优化实验条件，发展了FCSPs迁移液的细胞毒性评价方法。利用HeLa（子宫颈癌细胞）-NRU、HeLa-CCK-8（CellCountingKit-8，CCK-8）、HepG2（Human Hepatoblastoma）-NRU、HepG2-CCK-8共4种测试体系对中国市售的19种FCSPs进行了细胞毒性评价。样品在不同测试体系下的细胞毒性结果不同，其中65%的样品呈现中度毒性。FCSPs的整体生物安全性亟须关注并深入研究。本研究为食品接触材料的体外生物测定提供了研究思路和科学依据。

食品接触硅胶制品；模拟迁移；细胞毒性

食品接触硅胶制品（Food Contact Silicone Products，FCSPs）指各种适用于预期与食品接触或已接触食品的由硅橡胶制成的制品。作为食品接触材料（Food Contact Materials，FCMs）的一种，由于性能优良，FCSPs已广泛用于人们的日常生活中，如模具、蒸盘/盒、杯、管、垫和密封件等。在与食品接触过程中，其中的化学物质可迁移至食品中，从而给人体带来安全风险。FCSPs在使用过程中化学物质迁移所引起的食品安全风险不容忽视。目前，FCSPs的安全性研究仍主要集中在一些高风险化学物质及其迁移的相关研究，如硅氧烷[1-4]、重金属[5-6]、芳香烃[7]、N-甲基苯胺、N, N-二甲基苯胺、2,6-二叔丁基对甲苯酚及苯并噻唑等[8]。但是，由于受分离分析技术的制约，对硅胶制品中迁移物质的分析不可能是完整详尽的，特别是非有意添加物质（Non Intentionally Added Substances，NIAS）来源复杂，且部分NIAS化学结构不明，使得对NIAS的识别和量化非常困难且耗时。此外，在与食品接触过程中，终产品中的多种化合物可同时迁移，并共同作用于人体从而造成危害。因此，考虑到单一物质及其迁移的化学分析研究，无法评价终产品在使用过程中的整体安全性，亟须采用体外生物学评价对终产品的整体安全性进行研究。

近年来，作为化学分析的补充，FCMs的体外生物测定已被广泛关注。体外生物测定法可以检测出不能通过化学分析或定量结构-活性关系（Quantitative Structure-Activity Relationship，QSAR）预测FCMs的潜在毒性，能够提供FCMs化学迁移（混合物）的实际危险和质量评估的综合信息。其中，细胞毒性评价是FCMs体外生物测定的基本方法，也是遗传毒性以及内分泌干扰活性等研究的先行实验[9-10]。FCMs的细胞毒性评价方法可通过检测不同的毒性途径，如细胞通透性损伤和细胞增殖破坏等来进行，常见的方法有中性红摄入（Neutral Red Uptake，NRU）测定、噻唑蓝MTT或衍生物MTS测定、细胞中总蛋白质含量（Total Protein Content，TPC）测定、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxyuridine，BrdU）掺入实验等[11]，其中前2种是较为常用的方法。近年来，对FCMs的细胞毒性测定已被应用于塑料[12]、纸质[13]、罐头涂层[14]、纳米材料[15-16]等FCMs化学迁移物的毒性评价，但目前鲜见FCSPs迁移物的细胞毒性研究。

实验室前期已经使用HeLa细胞-中性红方法对FCSPs的细胞毒性进行了研究[17]，在此基础上，本研究考察了不同细胞系、不同细胞毒性测试方法、不同样品处理条件对细胞毒性的影响。通过系统优化实验条件，发展了FCSPs的模拟迁移液的细胞毒性评价方法，并利用HeLa-NRU、HeLa-CCK-8、HepG2-NRU、HepG2-CCK-8共4种测试体系对中国市售的19种FCSPs进行了细胞毒性评价。

1 实验

1.1 材料

测试材料：通过市场及电商购买了19种硅胶厨具（1号、4～7号、12号、15～18号为模具；2号、8～10号为蒸盘；3号为马卡龙垫；11号为蒸盒；13和14号为刻度量杯；19号为伸缩杯）。

细胞株：人宫颈癌细胞株（HeLa）和人肝癌细胞株（HepG2），由中日友好医院临床研究所提供。

阳性对照材料为有机锡作稳定剂的聚氯乙烯；阴性对照材料为高密度聚乙烯。

1.2 主要试剂与耗材

主要试剂与耗材：无水乙醇、二甲基亚砜，均为分析纯，北京化工厂；DMEM培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、磷酸盐（Phosphate Buffered Saline，PBS）缓冲液（1x），北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白酶（Trypsin）、青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin），Hyclone公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS），北京四季青生物科技有限公司；中性红细胞增殖及毒性试剂盒，上海碧云天生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8试剂盒，北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.3 仪器与设备

主要仪器与设备：Axiovert 200倒置显微镜，蔡司光学仪器上海国际贸易有限公司；细胞CO2培养箱，上海鄂禾仪器有限公司；ME104E电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；LMQ.C-100E高压灭菌锅，济南存昌生物技术有限公司；TGL-2150低温高速微量离心机，四川蜀科仪器有限公司；TTL-DC1水浴氮吹仪，禾缘天地仪器（北京）科技有限公司；BIOBASE2001型酶标仪，山东博科科学仪器有限公司；HY-4型振荡器，常州市瑞华仪器制造有限公司。

2 生物学检测

2.1 样品处理

样品迁移液的制备：样品用超纯水清洗、晾干、剪碎。准确称取20 g（±0.001 g）样品至50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL体积分数为95%的乙醇，盖紧塞子并用封口膜密封，70 ℃下保持2 h，降至室温后将迁移液转移至氮吹管中使用高纯氮气将迁移液吹干，加入1 mL DMSO复溶制成测试液，将测试液保存于4 ℃冰箱，24 h内进行细胞毒性实验。阴性和阳性对照样品用上述相同方法进行处理。

2.2 细胞培养、种板与暴露

细胞培养：由体积分数为10%的胎牛血清、体积分数为1%的双抗（青霉素和链霉素）、体积分数为89%的DMEM高糖培养液配制成完全培养基。细胞在CO2体积分数为5%和温度为37 ℃的二氧化碳培养箱中培养。

细胞接种：选取显微镜下生长状态良好的细胞，在超净台内经PBS缓冲液清洗、胰蛋白酶（质量浓度为0.25 g/mL）消化、离心后（1 800 r/min、5 min），弃上清，向离心管内加入适量完全培养基，充分吹打混匀，形成单细胞悬液；使用细胞计数板对细胞悬液进行计数，将密度调整到1×105个/mL，接种于96孔板中；设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和实验样品组，每孔中加入100 μL细胞悬液，每组至少6孔；接种后的96孔板置于温度为37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养24 h。

暴露：显微镜下观察96孔板中细胞长势，生长至70%～80%即可进行下一步操作。弃去孔中原培养液，空白对照组加入体积分数为1%的DMSO，阴性对照组加入高密度聚乙烯测试液，阳性对照组加入有机锡作稳定剂的聚氯乙烯测试液，实验样品组加入用培养基稀释得到的200、100、50、25、12.5 mg/mL样品测试液。每孔接种100 μL，混合均匀，放回培养箱继续培养24 h。

2.3 细胞毒性实验

NRU检测：弃孔板中原培养液，用PBS洗涤细胞，随后加入100 μL不含血清的DMEM细胞培养液，并加入10 μL中性红染色液，在细胞培养箱内孵育；2 h后去除孔板中含有中性红染液的细胞培养液，用PBS溶液洗涤细胞1～2次；加入100 μL中性红检测裂解液，在室温下，放置于平板摇床上，裂解10 min后取出，全自动酶标仪检测540 nm波长处的测吸光度。

CCK-8检测：弃孔板中原培养液，参照CCK-8说明书进行实验，96孔板每孔加入CCK-8和不含血清的DMEM培养液混合液100 μL（现配现用， CCK-8与DMEM的体积比为1∶9），放回培养箱继续培养，2 h后取出，在450 nm波长处测吸光度。

2.3.1 细胞毒性评价

各组细胞进行其相对增殖率（Relative Growth Rate，RGR）的计算，RGR值为实验组平均吸光度值与空白对照组吸光度值之比的百分数。根据相关标准[18]，RGR值对应的细胞毒性分级见表1。

表1 细胞毒性分级

2.4 数据处理及统计学分析

应用统计学软件SPSS20.0进行数据统计处理，实验结果用平均值±标准差表示，组间差异比较采用t检验，＜0.05表示数据有显著性差异。应用GraphPad Prism 8软件进行半抑制浓度（Half Maximal Inhibitory Concentration, IC50）计算。

3 结果与分析

3.1 FCSPs的模拟迁移条件

根据欧盟法规（EU）No 10/2011[19]规定，一般采用蒸馏水作为水性食品模拟物，将体积分数3%的乙酸作为酸性食品模拟物，体积分数95%的乙醇作为脂类食品模拟物，体积分数50%的乙醇作为乳类食品模拟物，模拟迁移的温度与时间依据样品实际使用温度和时间设定。在本研究中，由于样品种类丰富，检测量大，且样品形状不规则、薄厚不均，比表面积差异较大，因此最终选择相同质量的样品进行测试。考虑到“最严苛的使用条件（脂类食品接触）”和后续生物学实验检测相容性，最终选择体积分数95%的乙醇作为本研究的食品模拟液。此外，根据法规和文献，选择70 ℃持续2 h作为加速模拟的迁移条件[3]。

3.2 不同处理条件对细胞毒性的影响

尽管近年来FCMs的细胞毒性研究越来越多，但FCMs的细胞毒性评价尚无标准可依。不同的实验条件可能导致不同的实验结果。因此，本研究考察了1号样品的料液比（制品与食品模拟液用量比例）、浓缩程度（氮吹至1 mL和氮吹至干）、复溶介质（DMSO和体积分数为95%的乙醇）、暴露时间（12、24、48 h）等不同处理条件对HeLa细胞RGR值的影响（NRU检测）。

3.2.1 迁移比例对细胞毒性的影响

尽管欧盟法规（EU）No 10/2011[19]规定在进行FCMs化学迁移研究时采用6 dm2材料接触1 kg的食品或食品模拟物，但在FCMs的细胞毒性研究中，采用的迁移比例不尽相同。如Binderup等[20]用150 mL体积分数为99%的乙醇回流提取5 g食品接触用纸；Mittag等[14]将3 dm2罐头涂层在200 mL体积分数为95%的乙醇中模拟迁移；也有将0.5 dm2的塑料片浸入100 mL食品模拟物中的迁移过程[21]。本实验将20 g样品及20 mL体积分数为95%的乙醇（模拟液没过样品的最小体积）设料液比（g/mL）为1∶1，考察3种料液比（g/mL）（1∶1、1∶2、1∶3）对细胞毒性的影响（图1a）。结果表明，3种料液比对HeLa细胞的RGR值不存在显著性差异，考虑实验效率（减少后期大体积浓缩时间）和成本，最终选择20 g样品在20 mL体积分数为95%的乙醇中进行模拟迁移。

3.2.2 浓缩方式对细胞毒性的影响

已有研究中对进行细胞毒性实验的FCMs迁移液浓缩处理方式不同，如将乙醇迁移液干燥后用DMSO复溶[14, 19]，或是乙醇提取液直接经过浓缩后上样[13]。本研究探究了2种处理方式对细胞毒性的影响（图1b），结果显示，体积分数为95%的乙醇氮吹近干后加1 mL的DMSO复溶得到的RGR值显著低于体积分数为95%的乙醇氮吹至1 mL上样（＜0.01）的RGR值。这可能是由于DMSO比体积分数为95%的乙醇具有更好的溶解性，使得更多的物质作用于细胞而导致了更大的细胞毒性。考虑到更极端的迁移情况对细胞毒性的影响，最终迁移液的浓缩方式选择为氮吹至干，再加入1 mL的DMSO复溶。

3.2.3 复溶介质对细胞毒性的影响

体积分数为95%的乙醇和DMSO是FCMs细胞毒性实验中的常用溶剂[13-14]，但细胞对两者的耐受程度不同。本研究分别考察了体积分数为95%的乙醇和不同体积分数的DMSO（0、0.1%、0.25%、0.5%、1%、3%、5%、10%、20%）下对细胞毒性的影响（图1c）。结果表明，乙醇体积分数为95%并且DMSO体积分数在0.5%以内时，对细胞无明显影响。但是当DMSO体积分数超出0.5%时，随着体积分数的不断增加，RGR值逐渐呈下降趋势，且当DMSO体积分数为1%时，RGR值出现显著下降。DMSO体积分数在0.1%～1%时，细胞RGR值与对照组均无差异，但是当体积分数超出1%时，随着浓度的增加，RGR值呈下降趋势，且可以看到体积分数为3%时，RGR值出现显著下降。这说明细胞对DMSO的耐受浓度比体积分数为95%的乙醇的耐受浓度高，因此最终选择DMSO作为氮吹至干后的复溶介质，且进行后续细胞实验时的浓度不大于1%。

3.2.4 暴露时间对细胞毒性的影响

根据已有研究[22]报道的细胞暴露时间，本次研究考察了不同暴露时间（12、24、48 h）对细胞的毒性影响（图1d）。结果表明，在迁移液中暴露24 h和48 h对HeLa细胞RGR值无显著性差异（＞0.05），这与Vlad-bubulact等[23]、Ezati等[24]的研究结果一致。根据已有标准[25]规定，细胞在迁移液中暴露24 h后可以确定细胞毒性反应。此外，也有研究发现，暴露于FCMs迁移液48 h后，细胞对中性红摄取能力低于24 h[22]。本研究最终选择细胞在迁移液中暴露24 h。

图1 不同处理条件对细胞毒性的影响

注：*表示差异较显著，＜0.05；**表示差异显著，＜0.01；***表示与空白对照组相比差异极其显著，＜0.001。

3.3 食品接触硅胶制品迁移液的细胞毒性

分别利用NRU和CCK-8 2种测试方法，以及HeLa和HepG2 2种细胞构建了4种测试体系，即HeLa-NRU、HeLa-CCK-8、HepG2-NRU、HepG2-CCK-8，考察了19种FCSPs在不同质量浓度下（200、100、50、25、12.5 mg/mL）的细胞毒性。结果表明，4种测试体系中的阴性对照组RGR值大于80%，阳性对照组RGR值小于30%，说明测试体系均可靠。随着样品测试液浓度增大，其RGR值减小，细胞毒性增大，样品在HeLa-NRU测试体系中呈现剂量-效应关系，如图2中5号和7号样品所示。

图2 5号和7号样品（迁移液）在不同质量浓度下对细胞毒性的影响

注：*表示与空白对照组相比差异显著（＜0.05）；**表示与空白对照组相比差异极显著（＜0.01）；***表示与空白对照组相比差异极其显著（＜0.001）。

图3展示了19种样品在4种测试体系下的IC50值。由图3可以看出，19种样品迁移液在4种测试体系下的细胞毒性结果差异较大。图4展示了19种样品在最高上样浓度（200 mg/mL）下，在4种测试体系得到的RGR值。

在HeLa-NRU测试体系下，19种样品的IC50值为0.064（5号）～0.91 g/mL（15号），提示5号样品（模具）的细胞毒性最大，19号样品（伸缩杯）的细胞毒性最小。在200 mg/mL下，58%的样品（1、2、8、12～19号）的RGR值在57%～75%时，为细胞毒性2级；42%的样品（3～9、10、11号）的RGR值在27%～49%时，为细胞毒性3～4级。在HeLa-CCK-8测试体系下，10号样品（蒸盘）的细胞毒性最强，IC50值为0.095 g/mL。26%的样品（1、2、8、12、13号）的RGR值在55%～73%时，为细胞毒性2级；21%的样品（3、9～11号）的RGR值在30%～48%时，为细胞毒性3级。

在HepG2-NRU测试体系下，19种样品的IC50值为0.056（5号）～0.34 g/mL(16号），5号样品（模具）细胞毒性最大，与HeLa-NRU测试体系结果相同。37%的样品（3、8、12、16～19号）为细胞毒性2级，63%的样品（1、2、4～7、9～11、13～15号）为细胞毒性3级。在HepG2-CCK-8测试体系下，19种样品的细胞毒性最不敏感，IC50值为0.23 g/mL～8.21 g/mL，仅有3号样品（5%）的RGR值为75%，为细胞毒性2级，其余均为1级。总的来说，19种FCSPs中有1种样品（5号，模具）呈现重度毒性，12种样品（63%）在至少一种测试体系下呈中度毒性。

图3 19种FCSPs在不同测试体系下的 IC50值

在本研究中，使用同一细胞（HeLa或HepG2细胞）进行NRU和CCK-8测试，同一样品在2种测试方法中结果不同，这与李雪等[26]的研究结果一致。造成该结果的原因是这2种细胞毒性实验检测的毒性指标的差异。MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需加入有机溶剂被溶解后才能检测，增加了工作量，而且溶解甲瓒的有机溶剂会损害人体健康。而CCK-8法克服了MTT法检测的不足之处，CCK-8试剂被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲臜物，可直接进行测定，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比[27]。NRU实验是基于细胞对中性红的摄入能力来检测细胞增殖或细胞毒性的方法，主要对导致溶酶体破坏的细胞毒性反应灵敏[28-29]。Weyermann等[30]对这2种方法进行了比较，结果发现MTT比色法主要对影响线粒体酶活性的毒性反应敏感，NRU法主要对导致溶酶体破坏的细胞毒性反应灵敏。本研究结果表明，19种FCSPs无论是对HeLa细胞还是对HepG2细胞，NRU测试方法都比CCK-8测试方法更敏感。此外，在本研究中使用相同测试方法在HeLa和HepG2细胞中结果也不同，这可能是由于不同细胞对同一物质的耐受程度不同。已有报道指出不同的细胞毒性实验可能得出不同的结果，这取决于选择的受试系统和细胞毒性实验，因此多种测试方法或体系联用可以更全面地评价FCMs的细胞毒性[30]。评价毒性作用机理尚不明确待检化合物时，应合理地选择样品浓度、细胞类型和检测生物学终点的评价指标或评价方法，综合评价FCMs迁移液混合物的毒性，以增加结果的可信度。

图4 19种FCSPs的细胞毒性（200 mg/mL）

4 结语

作为化学分析的补充，体外生物检测可以确定混合迁移物危害和质量评估的综合信息。本文研究了不同测试体系下FCSPs细胞毒性的评价方法，为FCSPs以及其他FCMs的体外生物测定提供了研究思路和科学依据，为FCMs的安全评价体系提供重要的科学理论基础。样品在脂类食品模拟物（体积分数为95%的乙醇）中进行加速模拟迁移（70 ℃保持2 h）后，利用HeLa-NRU、HeLa-CCK-8、HepG2-NRU、HepG2-CCK-8共4种测试体系对中国市售的19种FCSPs进行了细胞毒性评价。结果表明，不同的测试方法和不同的细胞导致不同的细胞毒性结果。19种FCSPs中有13种（68%）在至少一种测试体系下呈中毒或重度毒性。推测FCSPs原料及添加剂中的重金属、硅氧烷、增塑剂和润滑剂等多种物质联合作用共同导致细胞毒性，因此，相关的体外生物安全性评价还需深入研究。总之，本研究为食品接触硅胶制品以及其他FCMs的生物安全性评价提供了研究思路和科学依据。

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Cytotoxicity Evaluation of Food Contact Silicone Products Marketed in China

GUO Yi-fan, ZHANG Jing-wei, FAN Xiao-jie, WANG Wen-juan, FENG Di*

(School of Light Industry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

The work aims to study the overall safety of food contact silicone products (FCSPs) by different in vitro cytotoxicity evaluation and test systems to study the difference of different in vitro cytotoxicity test methods. After the samples were simulated in 95% ethanol at 70 ℃ for 2 h, the cytotoxicity evaluation method of FCSPs migration was developed by systematically optimizing the experimental conditions. Four test systems including HeLa-NRU, HeLa-CCK-8, HepG2-NRU and HepG2-CCK-8 were used to evaluate the cytotoxicity of 19 FCSPs marketed in China. The samples showed different cytotoxicity results under different testing systems. Among them, 65% of the samples showed moderate cytotoxicity. The overall biological safety of FCSPs needs urgent attention and in-depth study. This study provides research ideas and scientific basis for the in vitro bioassay of food contact materials.

food contact silicone products; simulated migration; cytotoxicity

TB487；TS206.4

A

1001-3563(2023)19-0042-08

10.19554/j.cnki.1001-3563.2023.19.006

2023-04-15

国家自然科学基金面上项目（31871722）

责任编辑：曾钰婵