酸性熔盐水合物预处理麦秆高效制备木糖及其对酶解效率的影响

2023-10-14李由吴越钟禹林琦璇任俊莉

化工进展 2023年9期

李由，吴越，钟禹，林琦璇，任俊莉

（华南理工大学轻工科学与工程学院制浆造纸工程国家重点实验室，广东广州 510640）

木质纤维素类生物质是世界最丰富的可利用有机资源[1]。我国农业生物质资源丰富（如秸秆和玉米芯等），富含半纤维素组分[2-3]，是木糖的主要来源之一[3]。木糖可作为具有食品保健功能的甜味剂，可以进一步转化为化工原料糠醛[4]，还可以通过发酵转化为液体燃料乙醇[5]。

目前，木质纤维素制备木糖的方法众多，以酸解为主。Ouyang 等[6]采用88%（质量分数）的甲酸在固液比1∶10、100℃下处理芒草3h，木糖得率为74.90%。Luo 等[7]发现，采用1g Al2(SO4)3·18H2O、100mL H2O 预处理4g 玉米秸秆原料（130℃、4h），90.2%的半纤维素被选择性溶解并进一步转化为85.1%的木糖。Ji 等[8]在硫酸质量分数为0.5%、温度为140℃的条件下水解麦秸90min，木糖得率为91.5%。Zheng等[9]结合螺旋挤出机处理蒸汽爆破后的玉米芯，在操作时间1.5h、压力1.1×103kPa的情况下，木糖得率为80%。Loow等[10]用氯化胆碱（尿素和CuCl2组合）预处理油棕，在4h、120℃下，木糖得率为74%（14.76g/L）。以上不同预处理虽然效果较好，但存在预处理时间过长、预处理步骤繁杂甚至预处理条件苛刻等问题。此外，上述研究中木质素和纤维素发生大量降解，组分拆解选择性低，还存在对后续发酵有抑制作用的副产物[11]。因此探索一种半纤维素高选择性拆解的预处理方法是十分必要的。

无机熔盐水合物作为一种类离子液体状体系，制备容易且价格低廉，具有不易挥发、无毒性且环境友好性[12]。无机熔盐水合物可以作为溶解纤维素等多糖的介质[12]，但由于木质纤维原料存在天然抗降解屏障，阻碍了无机熔盐水合物直接作用于纤维素[13]，使得溶解纤维素所需的时间过长[14]。同时，因为半纤维素的无定形结构更易与熔盐水合物反应，在短时间内水合物对木质纤维中的半纤维素有着较高的选择性溶胀作用[15-16]。因此，本实验选择无机熔盐水合物作为半纤维素润胀剂。在众多无机熔盐水合物中，氯化锌水合物成本低且不易挥发[17]，所以将它作为预处理试剂。因短时间内仅溶胀半纤维素，所以需要添加Brønsted酸作为催化剂来使得润胀的半纤维素水解为单糖。与盐酸相比，硫酸不易挥发且易于储存，所以本实验采用硫酸作为酸性催化剂。

本实验采用氯化锌熔盐水合物溶液（ZnCl2·4H2O）协同稀硫酸作为预处理体系，研究了其对小麦秸秆预处理的效果。主要考察了预处理条件对半纤维素拆解以及定向解聚为木糖的效果，同时探究了预处理后小麦秸秆的酶水解情况。此外，还探讨了氯化锌的回收循环利用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

小麦秸秆，易高卓新节能技术（上海）有限公司，粉碎过筛后，选择40～60目部分，在体积比为1∶2的乙醇-丙酮混合液抽提8h，再经过蒸馏水洗涤后在45℃条件下烘干12h，得到脱蜡的小麦秸秆粉末。纤维素酶，丹麦诺维信（Novozyme）生物工程有限公司，滤纸酶活为138FPU/mL。实验中所用氯化锌、硫酸、盐酸、柠檬酸、柠檬酸钠等试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 氯化锌熔盐溶液的制备

将干燥的氯化锌溶解于去离子水中，使其质量分数达到65.4%[13]，然后在80℃下搅拌6h直到形成均一透明的ZnCl2·4H2O 熔盐水溶液，冷却至室温后，转移至冰箱冷藏保存。

1.2.2 酸性熔盐水合物处理

将20mL氯化锌水合物与2g脱蜡小麦秸秆粉末均匀混合于50mL圆底烧瓶中，在水浴锅加热搅拌，同时缓慢地添加硫酸溶液。反应一定时间后，固液分离，对滤液和残渣进行分析。考察总体积硫酸质量分数（1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%）、反应温度（70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃）、反应时间（5min、8min、10min、15min、20min）对原料组分拆解效率及单糖得率的影响。

1.2.3 酶水解

计算湿物料水分，取一定质量湿物料，保证其绝干后质量为0.2g，放入50mL 锥形瓶中，加入10mL 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（0.05mmol/L、pH=4.8），纤维素酶添加量为20FPU/g 绝干底物（138FPU/mL 滤纸酶活）。在50℃、150r/min 的恒温振荡器中酶解72h。反应中定时取样100µL上清液并灭活10min 后，通过0.22µm 水系滤头过滤，利用高效液相色谱仪（HPLC）进行糖含量分析。所有的测试均为一式三份进行，结果显示为平均值数值。酶解得率的计算[18]见式(1)。

式中，Yg为葡萄糖酶解得率，%；mg为样品中葡萄糖质量，g；mrc为酶解残渣中纤维素质量，g。

1.2.4 氯化锌的回收利用

预处理后，过滤分离残渣得到滤液，然后加入氢氧化铵水溶液，使得pH 在7～8 之间，再分离形成白色沉淀，加入盐酸水溶液使其溶解。最后将液体转移至蒸发皿中，冷冻干燥，得到氯化锌固体[19]。

1.3 分析方法

1.3.1 小麦秸秆组分分析

采用《煤的工业分析方法》（GB/T 212—2008）对抽提后小麦秸秆原料的水分、灰分、挥发分与固定碳组成进行测定

1.3.2 小麦秸秆三大组分分析

小麦秸秆经过预处理后的残渣中纤维素、半纤维素与木质素含量采用美国可再生能源实验室（NREL）分析方法测定[20]。实验中利用HPLC（Agilent 1200）进行定量分析（色谱柱为BIORAD Aminex HPX-87H 柱，流动相为5mmol/L H2SO4溶液，流速为0.5mL/min，柱箱温度60℃，检测器温度为40℃）。预处理后的纤维素保留率（N1，%）、半纤维素脱除率（N2，%）、木质素脱除率（N3，%）、木糖得率（N4，%）、葡萄糖得率（N5，%）、阿拉伯糖得率（N6，%）、固体回收率（N7，%）分别按式(2)～式(8)计算。

式中，M1为原料中纤维素质量；m1为残渣中葡萄糖质量；M2为原料中半纤维素质量；m2为原料中木糖与阿拉伯糖质量之和；m2'为残渣中木糖与阿拉伯糖质量之和；M3为原料中木质素质量；m3为残渣中木质素质量；M4为原料中木糖质量；m4为HPLC测得水解液的木糖质量；M5为原料中葡萄糖糖质量；m5为HPLC测得水解液的葡萄糖糖质量；M6为原料中阿拉伯糖质量；m6为HPLC测得水解液的阿拉伯糖质量；m为预处理前原料质量；m'为预处理后残渣质量。

1.3.3 响应面统计分析

通过软件Design-Expert 10 对自变量参数与响应值进行二次回归模型建立，响应面设计与方差设计。每组设置3个平行，通过在Design-Expert软件中选择Box-Behnken中心组合原理进行响应面实验设计，从而获得优化工艺条件[21]，并对优化结果进行5次重复。

1.4 表征方法

1.4.1 X射线衍射仪（XRD）分析

预处理前后小麦秸秆的结晶特性使用X射线衍射仪（XRD，D8-ADVANCE，德国布鲁克公司）进行测量。X 射线管为铜靶，管电压40kV，管电流30mA，采用2θ联动扫描，扫描范围为2°～60°，扫描速度4°/min。结晶指数（crystallization Index，CrI）由式(8)[22]计算。

式中，CrI 是结晶度；I200表示2θ=22.5°处纤维素结晶区范围的衍射信号强度；Iam表示2θ=18°处纤维素无定形区范围的衍射信号强度。

1.4.2 红外光谱（FTIR）分析

预处理前后对小麦秸秆的官能团变化分析使用傅里叶红外光谱仪（TENSOR 27 型红外光谱仪，布鲁克光谱仪器公司）进行探究。波数范围为400～4000cm-1，扫描时间为32s，分辨率为2cm-1，将样品与溴化钾粉末按照1∶80的质量比压制成薄且透明的薄片进行扫描[23]。

1.4.3 扫描电子显微镜（SEM）分析

使用场发射扫描电子显微镜（LEO1530VP型，德国ZEISS公司）观察预处理前后小麦秸秆表面形貌。先使样品均匀分散于导电胶之上，再对其进行镀金处理。

2 结果与讨论

2.1 预处理前后小麦秸秆化学组成变化

首先对抽提后的小麦秸秆进行工业组成分析，经检测，小麦秸秆中水分占4.87%，灰分占7.16%，挥发分占77.68%，固定碳占10.29%。脱蜡后小麦秸秆中纤维素质量分数36.49%，半纤维素质量分数23.13%，木质素质量分数20.58%。总体而言各个成分的测定值与相关文献报道的含量基本一致[24]，均在正常范围内。

为了探究氯化锌熔融盐水合物和硫酸的协同作用以及熔融盐水合物加入量的影响，考察了不同的预处理体系对秸秆组分的结果变化，其结果见表1所示。只经过熔盐水合物（ZnCl2·4H2O）预处理15min，半纤维素只有极少量的脱除，使得纤维素和木质素的占比略有升高，这是因为ZnCl2·nH2O（n≠3）本身就只是纤维素的弱溶胀剂[25]。同时熔盐水合物直接作用于小麦秸秆时，半纤维素和木质素组成的天然屏障会限制其与纤维素的接触[26]，所以不会对纤维素造成很强的破坏作用。当对小麦秸秆只进行3%稀硫酸预处理（100℃、15min）时，底物中半纤维素的质量分数产生了一定的下降，从23.13%降低至19.09%。降低程度不高的原因在于反应时间过短[27]，预处理效果不显著。而在采用稀酸结合熔盐水合物进行预处理后，预处理物料中半纤维素质量分数大幅降低（约3%），而纤维素与木质素质量分数迅速升高。硫酸和氯化锌熔盐水合物的协同预处理效果明显，主要因为氯化锌熔盐水合物的快速润胀半纤维素作用，使得稀酸能快速水解半纤维素。

表1 预处理前后物料组分含量

接下来，考察了预处理体系的固液比（1∶5、1∶10、1∶15）对预处理效果的影响，见表1。由表1 可知固液比对于处理效果的影响不是很明显，从拆解效率和溶剂用量等方面考虑，固液比为1∶10较好。

2.2 反应条件对预处理效果的影响

2.2.1 单因素实验

本研究考察了单因素硫酸质量分数、温度、时间对组分拆解效果的影响，见图1和图2。首先，固定反应温度（100℃）和时间（15min），考察了硫酸质量分数（1%～3.5%）对预处理效果的影响。如图1(a)所示，随着添加的硫酸质量分数从1%逐渐上升至3.5%，木糖得率由0迅速升高，在稀硫酸质量分数为3%的条件下，木糖得率最高，为90.73%（3.28mg/mL），且此时水解液中葡萄糖的得率小于5%。这是由于反应体系中的无机盐可以提高氢离子活性[28]，从而使得作为催化剂的硫酸更快地将润胀的半纤维素水解为单糖[29]，H+可以打断小麦秸秆中半纤维素间的糖苷键，从而促进半纤维素的水解[30]。半纤维素侧链上阿拉伯糖得率的变化趋势与木糖得率的变化趋势相似，迅速升高至85.28%。但是硫酸质量分数为1%的时候单糖没有形成，阿拉伯糖的得率为19.41%，说明半纤维素侧链优先断裂进入水解液。从图2(a)可以看出，预处理后残渣木糖含量随着硫酸质量分数的升高而降低，说明半纤维素拆解效率显著提高，因而导致纤维素和木质素含量升高。硫酸质量分数继续提高为3%～3.5%时，半纤维素脱除率变化不大[图1(b)]，仅相差0.02%，但纤维素保留率出现略微下降，降低了3.33%[图2(a)]。因此，在预处理过程中的适宜酸质量分数选定3%为宜。

图2 反应条件对预处理后残渣的组分含量影响

在硫酸质量分数3%下，考察了反应温度和反应时间对组分拆解效果的影响。固定反应时间为15min，随着反应温度的不断升高，各单糖得率显著提升[图1(c)]。当反应温度高于100℃，继续升高温度，半纤维素脱除率变化不大[图1(d)]，但从图2(b)可以得出此时残渣中纤维素比例迅速下降，这与图1(d)纤维素保留率降低明显相吻合，说明温度太高，纤维素解聚程度增加。固定反应温度100℃，考察反应时间对预处理效果的影响，见图1(e)。当反应处理5min 时，木糖得率较低（仅为19.45%），随着反应时间的增加，木糖得率逐渐增加，后变平缓，与半纤维素的脱除率趋势相近[图1(f)]。当反应时间由10min 增长至15min 时，木糖得率从60.18%增长至90.73%，升高了30.55%。结合图1、图2可以看出，硫酸质量分数为3.0%，反应温度选择为100℃，反应时间选择为15min，该条件下的预处理效果较好。

2.2.2 响应面实验

结合单因素实验，选取三个影响木糖得率的因素：温度（A）、时间（B）与硫酸质量分数（C），采用Box-Behnken 的中心组合设计原理设计三因素三水平的响应面实验。通过对表2 中结果的分析，获得回归模型ANOVA 分析与各因素间的主效应结果（图3）。由于模型的P值显著，失拟项不显著，说明实验因素受未知因素的干扰小。而拟合检验的结果显著则说明构建的模型是有效的，所以进行分析预测的结果是相对可靠的。因此可以利用此回归方程确定反应过程中木糖得率的最优工艺。

图3 三维响应面三种影响因素间两两的相互作用图

表2 方差结果分析

2.2.3 响应曲面图

图3所示是两因素交互作用的响应面三维空间曲线图，险峻程度反映影响的显著性，响应面的曲面越大，表明影响因素之间的差异更加明显，而椭圆形的等高线则说明交互作用显著[31]。根据结果显示，三个特性对木糖得率的影响从大到小进行排序为：时间＞硫酸质量分数＞温度。

2.2.4 模型验证

经过Design-Expert 软件计算并优化得到了最优的反应条件（温度97℃，时间19.0min，硫酸质量分数3.3%），此时预测最大值为91.91%。

对此，采用上述最优条件进行了验证实验，具体结果见表3。验证实验平行进行5 次，木糖得率均值为90.16%，基本与软件的预测值相同，最大偏差为2.34%，最小偏差为1.15%。结果表明，该模型对于木糖得率的分析是基本准确的，具有一定的实际应用价值。

表3 回归模型验证实验

2.3 XRD分析

小麦秸秆的结晶度对后续的酶解效果影响显著[32]，结合响应面分析中时间变量影响最大的结果，选取温度组样品探究其预处理前后结晶度的变化，结果如图4 所示。经过预处理后的纤维素晶型并未发生改变，为典型的Ⅰ型纤维素，这也与FTIR 的结果相一致。此外，随着反应时间延长至15min，结晶度由49.08% （原料）上升至61.04%，这是由于大量半纤维素的脱除引起的[33]。但随着反应时间的进一步延长，纤维素结晶度下降至56.97%，其原因是预处理时间过长纤维素的结晶区域也会受到一定破坏，从而导致CrI 值降低[34]。

图4 预处理前后小麦秸秆的X射线衍射光谱图

2.4 红外光谱分析

预处理时间对小麦秸秆结构的变化见图5。3400cm-1处的峰是由于O—H的拉伸振动所导致的。随着处理时间的变长，此处的特征峰变得越来越尖锐。这是由于随着反应时间的不断延长，纤维素、半纤维素和木质素之间的连接发生断裂，使得更多的纤维素暴露出来[35]。1364cm-1为I 型纤维素的红外特征吸收峰，表面预处理前后晶型并未改变，这与XRD 结果相对应。1736cm-1处的特征峰是半纤维素的C= = O 伸缩振动吸收峰[36]，随着处理时间的延长，吸收峰逐渐减弱并最终消失，此现象说明半纤维素的C= = O 键断裂，乙酰基脱离，半纤维素发生降解。1040cm-1是纤维素糖苷键的特征吸收峰[37]，随着预处理时间延长15min，该峰未发生明显变化，说明大部分纤维素未被降解，但延长反应时间至20min时，该峰明显减弱，表明纤维素逐渐降解，与图1(f)纤维素保留率发生下降的结果一致。1267cm-1是愈创木基木质素的C—H 振动吸收峰[38]，此处的特征峰几乎没有发生变化，说明木质素受到的破坏程度较小。

图5 小麦秸秆预处理前后红外光谱图

2.5 扫描电子显微镜分析

采用SEM 观察了不同预处理时间下小麦秸秆表面形貌的变化，见图6所示。抽提后的小麦秸秆在未经熔盐水合物预处理前，总体来看还是比较光滑且结构致密的。预处理时间5min 时，纤维表面结构出现了一部分破损与一定的褶皱；反应时间8min 时，纤维表面开始出现了少量孔洞，可能由于半纤维素的溶出并解聚造成；反应时间10min时，纤维表面的孔洞越来越多，说明半纤维素溶出的量增多，造成孔洞增多；反应时间15min时，表面结构的破坏程度也更加严重；反应时间20min时，纤维表面破坏严重，纤维素结构遭到很大破坏。总之，随着反应时间的越来越长，熔盐水合物对小麦秸秆三大组分之间形成的抗降解屏障的破坏也越来越强。纤维结构的破损是因为半纤维素的不断溶出所造成的，而表面褶皱的形成是因为脱除半纤维素后纤维的结构变得更加疏松导致的[39]。

图6 预处理后残渣的SEM图

2.6 氯化锌的回收利用

对于反应后得到的水解液，通过滴加氨水至中性的方式得到氢氧化铵锌沉淀[40]，然后通过滴加盐酸的方式将沉淀溶解，最后再经过冷冻干燥来回收氯化锌固体。如图7(a)所示，氯化锌和回收获得的氯化锌有着基本相同的2θ值，证明晶体结构没有受到破坏，该处理方式实现了对氯化锌的回收利用。从图7(b)可以看出，对回收获得的氯化锌进行5次循环利用后，在回收率依然保持较高水平（质量分数为80%）的同时，木糖得率依然维持在较高水平（＞87%，表4），对纤维素的解聚影响较小。而对于氯化锌的重复利用，避免了锌离子对环境的污染危害，从而实现了绿色的化学循环。

图7 回收氯化锌的XRD与循环回收率图

表4 回收氯化锌用于预处理的单糖得率

2.7 酶水解处理纤维素

考察了氯化锌熔融盐协同硫酸预处理对小麦秸秆酶水解效率的影响，见图8 所示。未经ZnCl2·4H2O 预处理的小麦秸秆，酶解72h葡萄糖得率为10.01%。随着预处理时间的增加，酶解得率呈现先迅速增加然后趋于平缓的趋势。这可能是因为酸性ZnCl2·4H2O 预处理加剧了半纤维素溶出并降解，破坏了木质素-碳水化合物复合体，使更多的纤维素暴露出来，提高了酶对纤维素的可及性，从而提高酶水解效率。预处理15min的样品经酶解72h后，酶解得率已经提升至77.81%（基于残渣纤维素）。半纤维素脱除得越多，小麦秸秆表面形成的孔洞越多，从而提高了酶的可及性，酶水解的效果会提高，从而葡萄糖得率提高。与Kim等[41]使用酸性氯化锌溶液在170℃下处理大麦秸秆20min后，在30FPU 的情况下酶解残渣96h，酶解得率仅为73.8%相比，本实验在15min、100℃、硫酸质量分数3%的预处理条件下，酶水解小麦秸秆72h，酶解得率便达到了77.81%，这可能是因为本实验预处理的温度相对较低，对纤维素的降解破坏程度较小，从而使得酶解得率更高。