脯氨酰4-羟化酶α亚单位3 在胃癌中的表达及临床意义

吴海兰，丁永玲，王正

扬州大学附属医院病理科，江苏 扬州 225000

全球癌症统计数据显示，2018 年胃癌发病率居全部恶性肿瘤第5 位，病死率居全部恶性肿瘤第3 位，具有病死率高、预后差的特点[1]。近年来，虽然胃癌的治疗及预后研究取得了一定进展，但已接受根治手术或有效放化疗患者的5 年生存率仍较低（﹤40%）[2]。因此，寻找与胃癌发生发展和预后相关的标志物具有重要意义。脯氨酰4-羟化酶（prolyl 4-hydroxylase，P4H）是一种高度保守的能够维持胶原稳定的必需酶，它是由2 个α亚基和2个β亚基组成的四聚体，而脯氨酰4-羟化酶α亚单位（prolyl 4-hydroxylase subunit alpha，P4HA）作为酶的活性位点，被鉴定为具有3 种α亚基，P4HA1基因编码α（Ⅰ），P4HA2基因编码α（Ⅱ），P4HA3基因编码α（Ⅲ），其中P4HA1 最为普遍[3]，P4HA2主要在成骨细胞、软骨细胞和毛细血管内皮细胞中表达[4]，P4HA3 在正常胎儿和成人组织中低表达[5]。既往研究报道，结直肠癌[5-7]、垂体腺瘤[8]、头颈部鳞状细胞癌[9]、乳腺癌[10]、肺癌[11]中P4HA3 表达水平均较高，P4HA3 能够促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，且其表达水平与肿瘤患者的预后有关，然而P4HA3 与胃癌发生、发展及预后的关系却少有报道。本研究首先通过生物信息学分析胃癌中P4HA3基因表达情况及与患者预后的关系，然后通过免疫组织化学染色法在蛋白水平上进一步验证，探讨P4HA3 在胃癌发生发展中的作用，旨在为胃癌的诊断和治疗提供新思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 生物信息学数据收集与处理

通过UALCAN 数据库[12]（http://ualcan.path.uab.edu/）分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中胃癌组织和癌旁正常组织中P4HA3基因表达差异，并进一步分析TCGA 数据库中不同临床分期、分化程度、年龄和性别胃癌患者P4HA3基因表达差异。合并来自GPL570 的3 个基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库中的胃癌数据集，分别为GSE13911、GSE79973和GSE19826。对3 个数据集进行log2（X）转化，并利用R 包“sva”进行数据合并和去批次效应。提取基因名为“P4HA3”的基因表达值，采用R 包“ggplot2”比较癌旁正常组织和胃癌组织中P4HA3基因表达量的差异。以P4HA3基因表达中位值为界，将患者分为P4HA3 高表达组和P4HA3 低表达组，采用Kaplan-Meier plotter 在线数据库比较两组患者的总生存时间、首次进展生存时间和进展后生存时间。

1.2 临床资料收集

收集2008 年1 月至2012 年12 月于扬州大学附属医院行胃癌根治术的胃癌患者。纳入标准：①经病理检查确诊为胃癌；②无免疫系统疾病；③术前未接受过化疗、放疗或其他抗肿瘤治疗。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②临床资料不完整。依据纳入和排除标准，本研究共纳入107 例胃癌患者，收集患者的胃癌组织及癌旁正常组织石蜡切片。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意。

1.3 免疫组织化学染色法检测P4HA3 蛋白表达及结果判定

免疫组织化学染色步骤：石蜡切片脱蜡水化，抗原修复，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，山羊血清封闭，滴加一抗P4HA3（1∶150）4 ℃冰箱孵育过夜，复温，滴加二抗山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）室温反应30 min，最后二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染，脱水封片，显微镜观察。

P4HA3 蛋白主要定位于细胞质，由2 位经验丰富的病理科医师阅片，每张切片选取2个视野，于高倍镜（×200 和×400）下计数200 个细胞，采用半定量法，根据染色强度和阳性细胞所占比例进行评分。染色强度评分：无色为0 分，浅黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。阳性细胞所占比例评分：无阳性细胞为0 分，阳性细胞所占比例≤25%为1 分，阳性细胞所占比例26%～50%为2 分，阳性细胞所占比例51%～75%为3 分，阳性细胞所占比例﹥75%为4 分。染色强度评分与阳性细胞所占比例评分相乘，0～2分为阴性（-），3～5分为弱阳性（+），6～8分为中等阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。

1.4 随访方法

以门诊或电话等方式对胃癌患者进行随访，特殊患者必要时上门回访，随访截止时间为2022 年12 月。总生存时间为术后至随访截止时间或患者死亡时间。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman 相关分析法进行相关性分析；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，组间比较采用Log-rank检验；以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA、GEO 数据库中胃癌组织和癌旁正常组织P4HA3 基因表达水平的比较

基于TCGA 数据库对胃癌组织和癌旁正常组织中P4HA3基因表达情况进行分析，结果显示，胃癌组织（n=415）中P4HA3基因表达水平明显高于癌旁正常组织（n=34），差异有统计学意义（P﹤0.01）。合并的3 个胃癌GEO 数据集显示，胃癌组织（n=60）中P4HA3基因表达水平为（5.810±1.140），明显高于癌旁正常组织（n=53）的（5.165±0.821），差异有统计学意义（P﹤0.01）。（图1）

2.2 TCGA 数据库中不同临床特征胃癌患者P4HA3 基因表达水平的比较

利用UALCAN 工具分析TCGA 数据库中不同临床特征胃癌患者P4HA3基因表达水平，结果显示，不同性别胃癌患者的P4HA3基因表达水平比较，差异无统计学意义（P﹥0.05）；不同年龄、分化程度、临床分期胃癌患者的P4HA3基因表达水平比较，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。（图2）

2.3 胃癌组织和癌旁组织中P4HA3蛋白表达情况的比较

107 例胃癌患者的胃癌组织中P4HA3 蛋白阳性表达率为80.4%（86/107），高于癌旁正常组织的15.9%（17/107），差异有统计学意义（χ2=4.935，P=0.026）。

2.4 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中P4HA3 蛋白表达情况的比较

不同肿瘤直径、分化程度、TNM 分期、T 分期胃癌患者胃癌组织中P4HA3 蛋白表达情况比较，差异均有统计学意义（P﹤0.05）；不同性别、年龄、N 分期、M 分期胃癌患者胃癌组织中P4HA3 蛋白表达情况比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。（表1、图3）

表1 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中P4HA3 蛋白表达情况的比较

图3 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中P4HA3蛋白表达情况（免疫组织化学染色，×200）

2.5 不同P4HA3 表达情况胃癌患者预后的比较

2.5.1 P4HA3 阳性表达与P4HA3 阴性表达胃癌患者预后的比较 采用Kaplan-Meier 法绘制胃癌患者的生存曲线，结果显示，P4HA3 阳性表达患者的中位总生存时间为38.5 个月，P4HA3 阴性表达患者的中位总生存时间为73.0 个月；P4HA3 阴性表达患者的累积生存率明显高于P4HA3阳性表达患者，差异有统计学意义（χ2=14.570，P﹤0.01）。（图4）

图4 P4HA3阳性表达（n=86）与P4HA3阴性表达（n=21）胃癌患者的总生存曲线

2.5.2 P4HA3 高表达组和P4HA3 低表达组胃癌患者预后的比较 Kaplan-Meier plotter 在线数据库分析发现，P4HA3 高表达组患者的中位总生存时间明显短于P4HA3 低表达组，差异有统计学意义（35.9 个月vs78.6 个月，P﹤0.01）；P4HA3 高表达组患者中位首次进展生存时间明显短于P4HA3 低表达组，差异有统计学意义（21.9 个月vs75.5 个月，P﹤0.01）；P4HA3 高表达组患者中位进展后生存时间明显短于P4HA3 低表达组，差异有统计学意义（8.4 个月vs17.1 个月，P﹤0.01）。（图5）

图5 Kaplan-Meier plotter在线数据库中P4HA3高表达组和P4HA3低表达组胃癌患者的生存曲线

3 讨论

P4HA3 首次在人颈动脉粥样硬化病变的纤维帽中发现，其可参与胶原的合成，虽然P4HA3 在正常组织中表达水平较低，但在多种类型肿瘤中高表达[13]。研究显示，结直肠癌组织中P4HA3 表达水平明显高于正常结直肠组织，其可促进结直肠癌细胞生长和转移[6]。另有研究报道，在垂体腺瘤[8]、头颈部鳞状细胞癌[9]、乳腺癌[10]、肺癌[11]中，P4HA3 呈高表达，且其表达水平与肿瘤患者的预后相关。此外，研究还发现，上皮-间充质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）诱导剂转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）可通过诱导P4HA3 表达来改变氨基酸代谢，从而导致体外和体内的肿瘤细胞具有恶性特征，说明P4HA3抑制剂可能是潜在的抗肿瘤药物[11]。然而P4HA3在胃癌中的作用却少有报道。

本研究通过UALCAN 数据库分析TCGA 数据库中胃癌组织和癌旁正常组织中P4HA3基因表达水平，发现胃癌组织中P4HA3基因表达水平明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P﹤0.01），随后分析了TCGA 数据库中不同临床特征胃癌患者P4HA3基因表达水平，发现不同年龄、分化程度、临床分期胃癌患者的P4HA3基因表达水平比较，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。为验证TCGA 数据库中显示的结果，本研究合并了来自GPL570 的3 个GEO 胃癌数据集，发现癌旁正常组织中P4HA3基因表达水平明显低于胃癌组织，差异有统计学意义（P﹤0.01），提示P4HA3 的表达可能与胃癌的发生发展有关。为进一步验证P4HA3表达与胃癌患者预后的关系，本研究应用Kaplan-Meier plotter 在线数据库比较P4HA3 高表达组和P4HA3 低表达组患者的生存情况，结果显示，P4HA3 高表达组患者的中位总生存时间、中位首次进展生存时间、中位进展后生存时间均明显短于P4HA3 低表达组，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。表明P4HA3 高表达与胃癌患者的预后不良有关。

有研究通过体外细胞实验证实P4HA3 能够促进胃癌细胞侵袭和转移，并提示其与胃癌预后相关[14-15]，但是缺乏来源于人体组织的验证。本研究收集107 例胃癌患者胃癌组织和癌旁正常组织石蜡标本，采用免疫组织化学染色法检测P4HA3 蛋白表达情况，并结合临床特征及随访资料进行综合分析，发现胃癌组织中P4HA3 蛋白表达水平明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P﹤0.01）；不同肿瘤直径、分化程度、TNM 分期、T 分期胃癌患者胃癌组织中P4HA3 蛋白表达情况比较，差异均有统计学意义（P﹤0.05）；P4HA3 阴性表达患者的累积生存率明显高于P4HA3 阳性表达患者（P﹤0.01），与生物信息学分析结果一致。以上结果均表明P4HA3 表达升高与胃癌的恶性生物学行为密切相关，并且很可能成为胃癌的预后评估指标和潜在治疗靶点，但其在胃癌中的具体作用机制有待进一步深入研究。

综上所述，P4HA3 在胃癌组织中高表达，且与胃癌的发生发展及预后有关，可能成为胃癌的预后评估指标和潜在治疗靶点。