黄芪多糖联合替加环素对白细胞减少性鲍曼不动杆菌感染肺炎大鼠的疗效及机制研究

顾盼瑾,张立红,胡锡池,沈丽娟,高 吟

(1.南京中医药大学附属医院 无锡市中医医院,江苏 无锡 214001;2.江南大学附属中心医院 无锡市第二人民医院检验科,江苏 无锡 214001)

鲍曼不动杆菌是非发酵菌属类革兰氏阴性杆菌,会引起院内感染,尤其在重症监护室中,因鲍曼不动杆菌感染的患者比例逐年增加[1]。鲍曼不动杆菌主要会侵袭有创机械通气、免疫功能不全、极度衰竭的患者,从而引起菌血症、肺炎、创伤感染、尿路感染、脑膜炎、心内膜炎等感染,鲍曼不动杆菌引起的院内感染死亡率较高[2-3]。近年来,随着器官移植、肿瘤放化疗及人口老龄化的出现,免疫受损的宿主日益增多,使用细胞毒性药物或糖皮质激素患者多会出现白细胞减少性免疫功能损害[4]。肺部感染是因白细胞减少性免疫受损宿主最易出现的主要死因及并发症,其临床表现不典型、起病隐匿、病情发展迅速,会导致患者出现严重的呼吸衰竭,使得患者死亡[5]。近年来因鲍曼不动杆菌多重耐药的出现,其耐药性已逐渐上升,因此因鲍曼不动杆菌引起的肺部感染已成为临床棘手的问题[6]。

有研究发现[7],因鲍曼不动杆菌引起的医院获得性肺炎死亡率在40%～80%,因鲍曼不动杆菌多重耐药菌株的增加,使得临床医师应对其病原体感染时,制定合理治疗方案较为困难。目前常用的药物包括舒巴坦、碳青霉素烯类、替加环素、多粘菌素类等。有研究针对鲍曼不动杆菌感染的治疗进行一些列动物模型试验及体外药敏试验,不同体外药敏试验检测方法使得药敏结果不一,而体外药敏试验多认为针对鲍曼不动杆菌替加环素的敏感率相对较高[8],而有研究发现[9],此类药物需联合应用可以起到相加或协同的作用,改善治疗效果。黄芪是我国的一味传统中药,黄芪多糖是是从黄芪中提取的水溶性杂交糖,具有抗炎、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤的作用[10],因此本研究分析了黄芪多糖联合替加环素对白细胞减少性鲍曼不动杆菌感染肺炎大鼠的疗效,并分析了作用机制,以为临床中白细胞减少性鲍曼不动杆菌感染肺炎提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 试验动物 购买75只雄性SD大鼠,体重140～200 g,SPF级,分笼饲养,自由进食、饮水。维持动物室温在(25±2)℃,保持环境安静、通风良好,室内维持12 h/12 h明暗交替,定期使用紫外灯进行消毒。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂:黄芪多糖购自中国药品生物制品检定所,分子式为C10H7ClN2O2S,分子量为254.69,纯度为95%。环磷酰胺购自Sigma公司,替加环素购自浙江海正药业股份有限公司,地塞米松购自Sigma公司,哥伦比亚血琼脂培养基购自梅里埃生物制品有限公司。大鼠基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、白细胞介素-6(Interleukin- 6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、酶联免疫吸附试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司(批号ml059268、ml064292、ml002859),大鼠Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)抗体及鼠克隆抗β-actin购自Abcam公司(批号ab22048、ab32536、ab8226)。

1.2.2 仪器:恒温二氧化碳培养箱购自美国NAPCO公司,酶标仪购自Molecular Devices,IX71型倒置显微镜购自日本Olympus公司,石蜡切片机购自上海莱卡仪器有限公司。

1.3 细菌准备 鲍曼不动杆菌由我院检验科提供,从慢性阻塞性肺疾病重症肺炎患者痰液中分离,经检验科细菌室鉴定后,将其冻存在-70 ℃冰箱中,之后行常规复苏,使用2 μl取菌环菌液接种在35 ℃琼脂培养中,将其置于恒温的培养中,在37 ℃下培养,选择典型的单菌落,将其转种于MH肉汤中,放置在空气恒温震荡箱中,在37 ℃下恒温摇床中,以70 r/min的速度孵育18 h,使用麦氏管测定,无菌0.9%氯化钠溶液配制为1.2×109CFU/ml(4个麦氏单位浓度)。

1.4 菌株鉴定 使用VITEK2 compact系统鉴定、测定病原菌的最小抑菌浓度,根据美国临床实验室标准化协会(2017)判定细菌耐药性,测定抗菌药物、最小抑菌浓度、结果,结果表明该菌株为鲍曼不动杆菌,其中替加环素的最小抑菌浓度为4 μg/ml,属于替加环素非敏感菌株,使用临床剂量的替加环素不能完全清除鲍曼不动杆菌,其鉴定的引物由上海英骏生物技术公司合成,引物:ITSF 5’-CATTATCACGGTAATTAGTG-3’,ITSB 5’-AGAGCACTGTGCACTTAAG-3’,扩增鲍曼不动杆菌的16 s RNA基因间隔区域,片段长约为208 bp。

1.5 动物分组及造模 实验开始前,将75只大鼠分为五组,而空白对照组、模型组、黄芪多糖组、替加环素组、黄芪多糖联合替加环素组,每组15只。造模前将所有大鼠称重,实验开始第1天,除空白对照组,其余组大鼠均腹腔注射30 mg/kg环磷酰胺,肌肉注射60 mg/kg地塞米松,减少大鼠的白细胞,以形成免疫抑制,正常对照组大鼠给予等剂量的0.9%氯化钠溶液。在第4天时,重复第1天的操作。在第5天,所有大鼠均用异氟烷进行麻醉,抓持大鼠后头部,将其伸入有异氟烷棉球的离心管中,当大鼠的眨眼反应消失后,用皮筋固定大鼠四肢、牙齿在固定台上,之后将大鼠的舌用止血钳拉出,固定在口外。之后在颈部进行剪毛消毒、备皮无菌操作,切开气管,将大鼠的上段气管暴露,使用带有导丝导管插入大鼠气管,插入约0.5 cm后,缓慢将导丝拔出,使用注射器将1.2×109CFU/ml(0.1 ml)鲍曼不动杆菌悬液经导管注入至大鼠的气管中,之后注入少量空气,将菌悬液注入大鼠的气管中。将固定台竖立,让大鼠保持直立20 s,将固定台左右摇晃,保证菌液分布在两肺中。空白对照组大鼠注入等量无菌0.9%氯化钠溶液,之后完成造模。

1.6 给药方法 动物造模后,所有大鼠灌胃给药,黄芪多糖组给予1 ml/100 g黄芪多糖,替加环素给予1 ml/100 g替加环素,黄芪多糖联合替加环素组给予1 ml/100 g黄芪多糖+1 ml/100 g替加环素,正常对照组和模型组大鼠给予等量的0.9%氯化钠溶液进行灌胃,五组均连续给药7 d。

1.7 观察指标

1.7.1 精神活动状况及大鼠的生存时间:观察五组大鼠的精神活动状况及大鼠的生存时间。

1.7.2 测定湿干比:五组大鼠分别在给药后第1天、第3天、第5天、第7天时,每组处死3只大鼠,处死后立即分离腹腔静脉、取血。在无菌条件下取出整肺,将右上肺叶组织进行称重(湿重),之后置于60 ℃烤箱中24 h,复称重作为干重,计算湿干比=湿重/干重×100%[11]。

1.7.3 血白细胞计数检测:五组大鼠分别在给药后第1天、第3天、第5天、第7天时取3只剪尾尖取20 μl血,使用全自动血液分析仪检测血白细胞计数。

1.7.4 细菌含量测定:五组大鼠分别在给药第1天、第3天、第5天、第7天时,在无菌条件下取左肺上叶,称重后加入0.9%氯化钠溶液1 ml,之后进行匀浆,取20 μl接种在M-H平板中,置于37 ℃摇床上,培养24 h,计算每克肺组织的细菌含量。

1.7.5 血清细胞因子检测:五组大鼠分别在给药后第1天、第3天、第5天、第7天时,将腹腔静脉血使用ELISA法检测五组大鼠的血清MMP-9、IL-6、TNF-α水平。

1.7.6 Western blot法检测蛋白表达:五组大鼠分别在给药后第1天、第3天、第5天、第7天时,取3只大鼠的剩余肺组织,根据说明书提取总蛋白,使用BCA法检测蛋白浓度。取30 μg/孔蛋白质样品上样,之后行SDS-PACE凝胶电泳,转移至聚偏二氟乙烯膜中,使用5%的脱脂奶粉进行封闭,加入一抗后在4 ℃下进行孵育过夜,用HRP标记的山羊抗IgG二抗,在室温下孵育1 h,ECL显色后用β-actin作为内参,通过内参的灰度比,得到要检测TLR4、NF-κB相对表达量。

2 结 果

2.1 造模结果 造模后,75只大鼠死亡10只大鼠,造模成功65只,造模成功率86.67%(65/75)。最终五组大鼠中空白对照组15只、模型组13只、黄芪多糖组12只、替加环素组13只、黄芪多糖联合替加环素组12只。

2.2 五组大鼠精神活动状况比较 模型组、黄芪多糖组、替加环素组、黄芪多糖联合替加环素组大鼠免疫受到免疫抑制后,出现了反应迟钝、弓背、光泽度较差易脱落、毛发竖立的情况,在接种鲍曼不动杆菌后,大鼠出现了嗜睡、进食减少、呼吸缓慢的情况,部分大鼠口、鼻、肛门周围出血的情况。空白对照组给药期间,大鼠的活动、饮食均正常,毛发有光泽;模型组大鼠饮食、活动均减少,毛发无光泽,竖立;黄芪多糖组、替加环素组两组大鼠的状态较模型组好,两组间大鼠状态无差别;黄芪多糖联合替加环素组给药后较黄芪多糖组、替加环素组大鼠状态好。

2.3 五组大鼠生存时间比较 所有大鼠给药7 d内均无死亡,模型组的生存时间为(10.52±1.08)d,黄芪多糖组为(12.52±1.85)d,替加环素组为(12.85±1.85)d,黄芪多糖联合替加环素组为(14.45±2.4)d,组间比较有统计学差异(均P<0.05),黄芪多糖联合替加环素组的生存时间明显较黄芪多糖组、替加环素组、模型组高,黄芪多糖组、替加环素组明显较模型组高(均P<0.05),黄芪多糖组与替加环素组比较无统计学差异(P>0.05)。

2.4 五组大鼠湿干比及白细胞计数比较 给药第1天,模型组、黄芪多糖组、替加环素组、黄芪多糖联合替加环素组的干湿比明显较空白对照组高,白细胞计数明显较低(均P<0.05);模型组、黄芪多糖组、替加环素组、黄芪多糖联合替加环素组组间的干湿比、白细胞计数比较无统计学差异(均P>0.05);给药第3天、第5天、第7天,模型组的干湿比明显较空白对照组、黄芪多糖组、替加环素组、黄芪多糖联合替加环素组高,白细胞计数明显较低;黄芪多糖组、替加环素组的干湿比明显较空白对照组、黄芪多糖联合替加环素组高,白细胞计数明显较低;黄芪多糖联合替加环素组的干湿比明显较空白对照组高,白细胞计数明显较低(均P<0.05);黄芪多糖组、替加环素组的干湿比、白细胞计数比较无统计学差异(均P>0.05)。见表1。

表1 五组大鼠干湿比及白细胞计数比较

2.5 五组大鼠细菌含量比较 空白对照组的细菌含量为阴性,给药第1天,模型组、黄芪多糖组、替加环素组、黄芪多糖联合替加环素组的细菌含量比较无统计学差异(均P>0.05);给药第3天、第5天、第7天,模型组的细菌含量明显较黄芪多糖组、替加环素组、黄芪多糖联合替加环素组高,黄芪多糖组、替加环素组明显较黄芪多糖联合替加环素组高(均P<0.05),黄芪多糖组与替加环素组组间比较无统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 五组大鼠细菌含量比较(g/kg)

2.6 五组大鼠血清细胞因子水平比较 给药第1天,模型组、黄芪多糖组、替加环素组、黄芪多糖联合替加环素组的MMP-9、IL-6、TNF-α明显较空白对照组高(均P<0.05);模型组、黄芪多糖组、替加环素组、黄芪多糖联合替加环素组组间MMP-9、IL-6、TNF-α比较无统计学差异(均P>0.05);给药第3天、第5天、第7天,模型组的MMP-9、IL-6、TNF-α明显较空白对照组、黄芪多糖组、替加环素组、黄芪多糖联合替加环素组高;黄芪多糖组、替加环素组的MMP-9、IL-6、TNF-α明显较空白对照组、多糖联合替加环素组高;黄芪多糖联合替加环素组的MMP-9、IL-6、TNF-α明显较空白对照组高(均P<0.05);黄芪多糖组、替加环素组的MMP-9、IL-6、TNF-α组间比较无统计学差异(均P>0.05)。见表3～5。

表3 五组大鼠血清MMP-9比较(pg/ml)

表4 五组大鼠血清IL-6比较(pg/ml)

表5 五组大鼠血清TNF-α比较(pg/ml)

2.7 五组大鼠TLR4、NF-κB相对表达量比较 给药第1天,模型组、黄芪多糖组、替加环素组、黄芪多糖联合替加环素组的TLR4、NF-κB相对表达量明显较空白对照组高(均P<0.05);模型组、黄芪多糖组、替加环素组、黄芪多糖联合替加环素组组间TLR4、NF-κB相对表达量比较无统计学差异(均P>0.05);给药第3天、第5天、第7天,模型组的TLR4、NF-κB相对表达量明显较空白对照组、黄芪多糖组、替加环素组、黄芪多糖联合替加环素组高;黄芪多糖组、替加环素组的TLR4、NF-κB相对表达量明显较空白对照组、多糖联合替加环素组高;黄芪多糖联合替加环素组的TLR4、NF-κB相对表达量明显较空白对照组高(均P<0.05);黄芪多糖组、替加环素组的TLR4、NF-κB相对表达量组间比较无统计学差异(均P>0.05)。见表6。

表6 五组大鼠TLR4、NF-κB相对表达量比较

3 讨 论

3.1 鲍曼不动杆菌感染疾病 鲍曼不动杆菌属是无动力、不发酵糖类、氧化酶阴性的革兰阴性球杆菌,在土壤、水、健康人皮肤表面均有广泛分布,会长期定植于机体的咽、皮肤、消化道、呼吸道。在临床中分的不动杆菌多数为鲍曼不动杆菌,占比约为72.9%,其他菌种引起的感染较少[12]。其在高危人群中会有严重感染,包括患者免疫力低下、住院时间长、心肺功能衰竭、机械性通气、静脉插管、留置导尿管等患者中,会使患者出现医院获得性肺炎,尤其是呼吸机相关的肺、菌血症、伤口感染、继发性脑膜炎、尿路感染等[13]。医院感染的一个重要病原菌是鲍曼不动杆菌,其是条件致病菌,是革兰阴性球杆菌,经革兰染色后不易脱色,专性需氧菌,触酶阳性、无动力、氧化酶阴性,在20～30 ℃温度下生长良好,没有特殊的营养要求,抵抗力强,可在医护人员和患者间传播,出现鲍曼不动杆菌感染的ICU病房,患者枕头、标本、 病历、仪器、医护人员手套等上均可分离到鲍曼不动杆菌[14]。近年来,因鲍曼不动杆菌引起的医院感染不断增加,同时其耐药性也在不断增加,临床上多从抗菌方面使用西医治疗细菌感染,用多种抗生素起到杀菌、抑菌的作用,而不能完全控制感染,同时耐药问题较多,使得临床上存在一定局限性[15]。

3.2 动物感染性肺炎模型 目前对于诱导肺部感染主要有4种方式:经支气管气管注入、直接暴露感染、经鼻注入、经口注入,本研究经口插管法将接种物送进动物的下呼吸道,其是直接用钝性针经口腔进入气管,导入接种物,因此无切口,避免了对动物的损伤[16]。而本方法需要使用麻醉,增加了大鼠的死亡风险,本研究死亡的10只大鼠中4只因麻醉过度死亡。

3.3 黄芪多糖联合替加环素对白细胞减少性鲍曼不动杆菌感染肺炎的作用 《中国药典》(2015年)记载说明黄芪是具有利水消肿、补气升阳作用的中药,临床中可广泛应用于糖尿病、高血压、肾病综合征疾病治疗中[17]。黄芪多糖是黄芪的一个主要成分,其可用于抗氧化、糖尿病、肝纤维化治疗中[18]。本研究将黄芪多糖用于白细胞减少性鲍曼不动杆菌感染肺炎大鼠中,发现联合应用替加环素后,其可明显降低大鼠的 MMP-9、IL-6、TNF-α水平,且二者联合应用MMP-9、IL-6、TNF-α水平明显较单一用药高,表明黄芪多糖联合替加环素可明显降低白细胞减少性鲍曼不动杆菌感染肺炎大鼠的炎症因子水平。其中MMP是基质金属蛋白酶家族,在水解后可以降解细胞外基质,降解组织连接蛋白活性,从而诱发气道炎症反应。TNF-α是参与全身炎症反应的一种细胞信号蛋白,仅存在于血液中,广泛存在于多种组织中。TNF-α会损害肺组织内的溶酶体,从而损伤肺泡上皮细胞、肺血管内皮细胞,IL-6是多种免疫细胞,如T淋巴细胞、单核/巨噬细胞等,会产生多效急性细胞因子,其在介导机体炎症反应、免疫中起到重要作用。因此本研究选择MMP-9、IL-6、TNF-α作为炎症因子。

3.4 黄芪多糖联合替加环素降低白细胞减少性鲍曼不动杆菌感染肺炎炎症水平的作用机制 TLR4信号下游的一个重要核转录激活因子是NF-κB,TLR4会与配体结合,诱发多种下游效应,使得NF-κB活化,从而促进机体分泌白介素等炎症因子,使得巨噬细胞、粒细胞产生趋化聚集效应,从而引起急性炎症反应。NF-κB可以通过上调细胞环氧化酶的表达及活性,从而增加炎症因子合成增加,促进炎症反应[19]。鲍曼不动杆菌会诱导机体出现炎症反应,从而在肺中出现炎症细胞积聚,以白细胞为主,其会结合TLR4,促进NF-κB等分子活化,诱导MMP-9过度表达,同时分泌TNF-α、IL-6等因子。而NF-κB会对MMP-9转录水平进行调控,会抑制蛋白IkBα,使IkBα处于稳定状,当细胞受到刺激时,IkBα会被降解,从而调控MMP-9转录过程[20]。本研究发现,给予黄芪多糖联合替加环素后降低了白细胞减少性鲍曼不动杆菌感染肺炎的MMP-9、TNF-α、IL-6等炎症因子生成,减少炎性细胞浸润,从而起到保护血管壁的作用,改善肺功能。

总之,黄芪多糖联合替加环素对白细胞减少性鲍曼不动杆菌感染肺炎大鼠有一定疗效,可能与其可通过TLR4/NF-κB通路改善炎症水平有关。