睡莲酚对小鼠酒精性肝损伤的保护作用

郭子雨,赵军,姚雨含,李晨阳

(1.新疆大学生命科学与技术学院,新疆 乌鲁木齐 830046;2.新疆维吾尔自治区药物研究所维吾尔药重点实验室,新疆 乌鲁木齐 830004)

酒精性肝损伤(alcoholic liver injury,ALI)是由于长期或大量饮酒所导致的肝脏细胞结构异常和功能障碍性疾病[1-2]。若无有效的治疗方法,ALI会进一步发展成为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。近年来,ALI已成为肝脏损伤的第二大病因,仅次于病毒性肝炎[3-6]。睡莲花(Nymphaeacandida)为睡莲科睡莲属植物雪白睡莲的干燥花蕾,具有清热补心、湿脑安神、降热养肝之功效,临床用于心虚、肝虚以及热性感冒等疾病的治疗,是维吾尔抗肝炎复方制剂炎消迪娜尔糖浆的主要药味之一。研究显示,睡莲酚(isostrictiniin)是该药材的主要特征性化合物,对半乳糖胺、刀豆蛋白诱导的急性肝损伤以及四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化均显示了较好的防治作用[7-11]。因此,本文通过小鼠急性ALI模型研究睡莲酚对ALI的防治作用及其作用机制,以期可为睡莲花的开发利用提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物SPF级雄性昆明种小鼠72只,体重18～22 g,购自新疆医科大学实验动物中心:生产许可证号:SCXK(新)2018-0002,实验动物使用许可证号:SCXK(新)2018-0002,伦理审查编号:IACUC-20220314-2。饲养条件:温度22～23 ℃,湿度40%～50%,换气良好,环境清洁,无外来传染源,自由饮食和饮水。

1.1.2 主要试剂睡莲酚(自制,纯度98.7%);52°二锅头白酒(北京红星股份有限公司);联苯双酯滴丸(Bifendate Pills,DDB;H11020980,北京协和药厂);总超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、甘油三酯(TG)试剂盒(A001-3、 A003-1、A006-2-1、A110-2-1,南京建成科技有限公司);小鼠白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)Elissa试剂盒(JR18442D、JR20268D、 JL10484D,上海江来生物科技有限公司);油红O和HE染色试剂盒(G1261、G1120,北京索莱宝公司);其他试剂为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器Caris 200全自动化学发光免疫分析仪(厦门优迈科医学仪器);Varioskan Flash酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司);HZQ-C全湿恒温培养摇床(上海一恒科学仪器有限公司);HC-3018R高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司);KDC-2046低速冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及处理小鼠ALI造模参照文献[12]方法。将健康雄性昆明小鼠72只适应性喂养1周后,根据体重随机分为正常组、模型组、阳性对照联苯双酯组(DDB,63 mg·kg-1)和睡莲酚低中高剂量组(25、50、100 mg·kg-1),每组12只。每天按设定剂量灌胃给药,正常组和模型组灌胃给予等量蒸馏水。每次给药2 h后,除正常组外,其余各组小鼠灌胃给予52°白酒(13 mL·kg-1),连续7 d。末次给药并禁食16 h后,摘眼球取血,静置后,3 000 r·min-1离心20 min,分离血清,冻存于-80 ℃ 冰箱待检。颈椎脱臼处死小鼠,摘取肝脏,称重,计算肝脏指数:肝脏指数(mg·g-1)=脏器质量(mg)/体质量(g)。将部分肝组织以预冷生理盐水冲洗,置于4%多聚甲醛中固定,用于病理学观察;再以锡箔纸包裹剩余肝脏放入液氮中速冻后放入-80 ℃冰箱待测。

1.2.2 血清生化指标的测定采用全自动生化仪检测小鼠血清ALT、AST、TG和TC含量。

1.2.3 肝组织生化指标的测定精密称取小鼠肝组织,按照重量体积比加入9倍体积的生理盐水,剪碎组织,冰水浴中制备匀浆,3 500 r·min-1,离心10 min,取上清液按照试剂盒说明,测定小鼠肝组织MDA、GSH、SOD、TNF-α、IL-6、IL-1β及TG水平。

1.2.4 病理组织学检查常规石蜡包埋,切片,进行HE及油红O染色,在光镜下观察肝组织病理学变化。

1.2.5 RT-PCR检测Keap1、Nrf2、NQO1的mRNA表达以离心柱法抽提肝脏组织中的总RNA。在冰上配制体系进行反转录实验,以实时荧光定量PCR考察mRNA的表达量。

表1 RT-PCR引物序列组成

2 结果与分析

2.1 睡莲酚对ALI小鼠血清AST、ALT水平及肝脏指数的影响在试验过程中,正常对照组小鼠生长状况良好,食欲旺盛,毛发光泽,未发生死亡;而模型组小鼠随着造模时间延长,小鼠口唇发绀,粪便干硬偏黄,小鼠食量减少,体形消瘦,且死亡4只,说明酒精对小鼠产生严重的损伤,造模成功。此外,在试验期间,联苯双酯组小鼠死亡1只,睡莲酚中高剂量组各死亡2只,其低剂量组死亡3只;死亡原因同模型组。如图1所示,模型组小鼠的肝脏系数明显高于正常对照组(P<0.05),说明小鼠摄入酒精后出现肝脏肿大。睡莲酚中、高剂量组(50、100 mg·kg-1)能明显降低酒精升高的肝脏系数(P<0.05)。与正常对照组相比较,模型组小鼠血清ALT、AST含量明显增加(P<0.01),分别升高了81.9%、51.6%,说明酒精造成了肝细胞损伤。与模型组相比,睡莲酚高剂量组(100 mg·kg-1)能明显降低小鼠血清ALT活性(P<0.01)。结果表明睡莲酚具有改善肝功能的作用,能够减轻酒精所诱导的肝损伤。

图1 睡莲酚对ALI小鼠血清ALT、AST以及肝脏系数的影响

2.2 睡莲酚对ALI小鼠血清TG和TC水平及肝组织TG水平的影响由图2所示,与正常组相比,模型组小鼠血清TG、TC水平以及肝组织TG水平显著升高(P<0.01),说明大量酒精摄入导致肝组织及血液中的脂肪含量增加。与模型组相比,睡莲酚中、高剂量组(50、100 mg·kg-1)均能使小鼠血清TG、TC含量及肝组织TG含量显著下降(P<0.01),且呈现出了剂量-效应依赖关系。结果表明睡莲酚可以降低血液中的脂肪含量,具有较好的抗脂肪变性和脂肪沉积作用,可以防治酒精性脂肪肝的发生。

图2 睡莲酚对ALI小鼠血清TG、TC及肝组织TG水平的影响

2.3 睡莲酚对ALI小鼠肝组织MDA、GSH、SOD水平的影响如图3所示,与正常组相比,模型组小鼠肝组织中MDA含量明显增加(P<0.01),说明酒精导致的脂质过氧化,损伤了肝细胞。睡莲酚低、中、高剂量组(25、50、100 mg·kg-1)能显著降低酒精损伤致小鼠肝组织MDA的升高(P<0.01)。与正常组相比,模型组小鼠肝组织GSH和SOD活性显著降低(P<0.01),说明酒精导致的氧化损伤加快了抗氧化物质的消耗。与模型组相比,睡莲酚低、中、高剂量组(25、50、100 mg·kg-1)小鼠肝组织GSH和SOD活性明显升高(P<0.01)。结果说明睡莲酚可通过抑制肝细胞脂质过氧化以及提高抗氧化物水平减轻酒精诱导的肝损伤。

图3 睡莲酚对ALI小鼠肝组织GSH、MDA、SOD水平的影响

2.4 睡莲酚对ALI小鼠肝组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影响由图4可见,与正常组相比较,模型组小鼠肝组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著增加(P<0.01),差异具有统计学意义。与模型组相比,睡莲酚中、高剂量组(50、100 mg·kg-1)均能明显降低小鼠肝组织TNF-α、IL-1β和IL-6水平(P<0.05,P<0.01)。结果表明,睡莲酚可通过促炎细胞因子的调控发挥肝保护的作用。

图4 睡莲酚对ALI小鼠肝组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响

2.5 睡莲酚对ALI小鼠肝组织病理学的影响HE染色结果见图5,正常肝细胞边界清晰有序,细胞核和静脉毛细血管结构清晰,未见炎性细胞浸润和体细胞转化。模型组小鼠肝组织有显著改变,肝细胞变大,排列不整齐,而且有不规则脂肪空泡产生,肝血窦充血和炎性细胞浸润。与模型相比,睡莲酚剂量组的小鼠肝组织病理损伤均得到不同程度的改善,且有显著的剂量-效应趋势。睡莲酚低剂量组与模型组小鼠相近,但肝细胞肿胀和体细胞之间的边界仍然存在,而中、高剂量组小鼠肝组织结构较为正常,虽可见散在脂滴,但细胞间有着清晰的界限,不规则脂肪空泡减少,未见明显炎症。

A.HE染色;B.油红O染色

油红O染色结果与HE染色结果是相同的,在模型组小鼠肝细胞中,可以看到很多红色脂滴,联苯双酯组和各剂量睡莲酚组红色脂滴下降显著,而且睡莲酚组均呈现明显的剂量-效应趋势,联苯双酯组与睡莲酚高剂量组程度相近。

2.6 RT-PCR法检测ALI小鼠肝脏组织Keap1、Nrf2和NQO1的mRNA表达如表2所示,与正常组比较,模型组小鼠肝组织Nrf2、NQO1 mRNA的表达显著减弱(P<0.01),Keap1显著增强(P<0.01),说明酒精灌胃促进了Keap1/Nrf2信号通路相关基因的转录,提示酒精肝损伤可能与其激活Keap1信号通路相关基因转录有关。与模型组比较,睡莲酚低、中、高剂量组(25、50、100 mg·kg-1)小鼠肝组织中Nrf2、NQO1 mRNA的表达水平显著增强(P<0.05,P<0.01),Keap1显著降低(P<0.01),提示受试药物及联苯双酯对肝损伤小鼠的保护作用,可能是通过调节Keap1/Nrf2通路实现的。

表2 睡莲酚对ALI小鼠肝组织Keap1、Nrf2、NQO1 mRNA表达水平的影响

3 讨论

酒精性肝损伤的发病机制非常复杂,多种途径参与其中,但氧化应激已被认为在酒精性肝病的发生发展中具有重要作用。当肝脏功能不全或是大量饮酒时,超过机体的代谢能力,乙醇氧化分解的速度变慢,则容易发生肝脏损伤。酒精的过量饮用可抑制肝组织中GSH及SOD等抗氧化酶的合成,同时会导致H2O2、·OH等自由基的大量产生,引起脂肪过氧化,产生氧化应激反应,导致肝细胞损伤,AST、ALT和MDA水平升高。作为脂肪代谢及检测脂肪氧化的重要指标,在酒精引起的肝损伤中,TG、TC水平也显著增加。睡莲酚能降低AST、ALT、TG、TC水平及肝组织MDA水平,说明睡莲酚确有明显的保肝降酶作用(TG、TC是血脂指标)。

细胞因子代谢异常是ALI的一个主要特征,在ALI发生发展过程中有重要作用。ALI小鼠的血清中,促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β显著升高,这些因子的表达水平与疾病的严重程度相关[13]。睡莲酚给药后,TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显降低,显示睡莲酚通过抗炎活性发挥肝保护作用。病理学观察也证实了这一点。

氧化应激通路中的相关蛋白Nrf2是一种转录因子,诱导各种氧化应激反应中下游基因的编码解毒酶和抗氧化蛋白[14]。生理状态下,Nrf2与Keap1结合,其活性受到抑制。酒精刺激引发氧化应激反应导致Keap1和Nrf2分离,Nrf2解离后进入细胞核,与转录因子结合后,再与抗氧化反应原件(ARE)结合,启动超醌氧化还原酶1(NQO1)等下游基因的转录与表达,从而发挥抗氧化应激损伤作用[15-16]。实验结果显示,经睡莲酚预防性给药后,Nrf2和NQO1 mRNA表达较模型组显著上升,抗氧化通路被激活,加速了自由基的清除,改善了氧化应激引起的肝损伤。以上研究结果说明,睡莲酚对ALI确有较好的防治作用,其机制与Keap1/Nrf2抗氧化通路的激活、促炎因子的调控相关。