循经通络推拿手法结合药物对乳腺增生大鼠雌孕激素及其受体水平的调节作用

李 丽，纪 宁，阮 迪，李丹丹

（新疆维吾尔自治区中医医院推拿科，乌鲁木齐 830099）

乳腺增生症（mammary gland hyperplasia, MGH）是由于雌激素分泌失调导致的乳腺慢性良性增生疾病，以一侧或两侧乳房肿块、周期性胀痛为主要临床表现[1]。乳腺增生是中青年女性的常见病，其发病率占全部乳房疾病的75%，且存在一定的癌变率，严重影响患者的身心健康[2]。目前乳腺增生的治疗主要以口服激素类药物缓解临床症状，或手术治疗为主，但都存在远期疗效差，治疗后易复发的问题。推拿治疗安全有效且价格低廉，在乳腺增生的非手术治疗中具有很大优势[3]。但其作用机制尚不明确，影响了临床的推广应用。本实验采用外源性激素注射法制备乳腺增生大鼠模型，通过观察循经通络推拿手法及临床常用药三苯氧胺对乳腺增生大鼠乳头直径、乳头高度，乳腺组织形态，E2（雌二醇）、P（孕激素）及其受体的影响，对比推拿手法治疗、药物治疗与手法联合药物的治疗效果，并探讨其治疗乳腺增生的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 SPF 级SD 雌性大鼠50 只，由新疆医科大学动物实验中心提供，体质量180 ～220 g，饲养温度（23±3）℃，相对湿度40%～70%，按体质量随机分为5 组（对照组、模型组、手法组、药物组、药物加手法组），每组10 只。

1.2 主要试剂 苯甲酸雌二醇注射液、黄体酮注射液购自北京索莱宝有限责任公司，三苯氧胺购自上海华联制药有限公司，苏木素染液购自福州迈新生物技术开发有限公司，伊红染液购自北京中杉金桥生物技术有限公司，大鼠雌二醇（E2）、大鼠孕激素（PROG）ELISA 检测试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司，抗雌激素受体α（ERα）、抗孕激素受体（PR）一抗购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 主要仪器 TGL-16GB 型台式低速离心机（上海飞鸽仪器有限公司），高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技公司），酶标仪（美国Bio-Rad 公司），光学显微镜（日本尼康），凝胶成像系统（上海天能），DYCZ-24DN 型电泳仪（北京六一），蛋白转膜仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.4 造模方法 除对照组外，模型组、手法组、药物组和药物加手法组均采用肌肉注射雌二醇和黄体酮法制备大鼠乳腺增生模型[4]：大鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液（0.5 mL/kg），每日1 次，持续25 d，第26天起肌肉注射黄体酮注射液（5 mg/kg），每日1 次，连续5 d。造模结束后观察各组大鼠乳头外观形态，测量大鼠乳头直径，并取乳腺组织行HE 染色观察病理变化。以大鼠乳头红肿竖起高于皮肤表面，乳头直径增大，病理染色见乳腺小叶增多、导管及腺泡增生等形态为造模成功。

1.5 治疗方法 手法组于造模同时予以循经通络推拿手法治疗，将大鼠固定于固定板，使用电动剃毛器充分剃毛后涂抹适量刮痧油，参照“大鼠穴位图谱”操作，具体步骤如下：1）指腹直推手三阴经（前肢内侧至腋窝处），并延乳房外围向乳头方向指揉乳络；2）指腹直推足三阴经（后肢内侧根部至后掌足跖）；3）指腹直推任脉（颈部至耻骨）、督脉（颈部至尾根部）；4）指尖推揉乳房部；直推、按揉力度适中、速度均匀、顺逆经交替，至局部皮肤发红发热。每次治疗10 min，每日1 次，持续 30 d。药物组在造模同时给予三苯氧胺（0.5 mg/kg）每日灌胃治疗，持续30 d。药物加手法组在给予三苯氧胺（0.5 mg/kg）灌胃的同时予以循经通络推拿手法治疗，每日1 次，持续 30 d。对照组与模型组大鼠不予干预。

2 检测指标

2.1 一般状态观察 治疗结束后，测量各组大鼠的体质量，同时观察大鼠精神状态、被毛情况和活动状况。

2.2 大鼠乳头直径与高度测量 治疗结束后，用精密游标卡尺测量各组大鼠第2 对左右乳头直径和乳头高度，比较模型组与对照组，各治疗组与模型组大鼠乳头直径、乳头高度的差别。

2.3 HE 染色观察大鼠乳腺组织病理形态变化 治疗结束后，大鼠腹主动脉取血并处死，解剖后取右侧第2 对乳房，取乳腺组织于4 %多聚甲醛溶液中固定，常规脱水、透明后进行石蜡包埋，切片机作 5 μm 切片，再经脱蜡至水、苏木素-伊红（HE）染色、70%盐酸乙醇分化、梯度乙醇脱水、二甲苯透明后封片，光学显微镜观察乳腺组织病理形态学改变。

2.4 ELISA 检测大鼠血清中E2、P 含量变化 治疗结束后，各组大鼠腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）麻醉，腹主动脉取血，3 000 r/min 离心10 min 取血清，置于-20 ℃冰箱保存。血清常温下放置1 h，3 000 r/min离心15 min 后检测：样品孔加入待检样品10 μL，样品稀释剂加入40 μL，加入抗体100 μL，置于37 ℃孵育1 h 后洗板5 次。各反应孔加入底物液A、B 各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，随后加入终止液50 μL，于酶标仪450 nm 下检测OD 值。建立标准曲线，计算各样本E2、P 含量。

2.5 Western-blot 检测大鼠乳腺组织中ERα、PR 的蛋白表达 取各组大鼠部分乳腺组织置于裂解液中，匀浆器于冰上匀浆，4 ℃离心机12 000 r/min 离心 20 min提取组织总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。制胶后取10 μL 蛋白样品上样，电泳分离，冰上转膜，室温下封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次，二抗室温孵育2 h，TBST 洗膜3 次，滴加ECL 发光液，凝胶成像分析系统曝光并拍照，用Image J 软件进行定量分析，计算目标蛋白与相应内参的灰度值比值，分析相对蛋白含量。

2.6 统计学方法 采用 SPSS 19.0 软件进行统计学分析，数据均以均值±标准差（±s）表示，2 组以上数据采用单因素方差分析比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般状态观察 实验过程中各组大鼠饮食饮水正常；大小便正常，大便成形，未见稀便，小便颜色正常。各组大鼠皮肤完整无溃烂，毛发光泽柔顺；精神活跃、捕捉抵抗适中。模型组大鼠经造模后，乳头直径和高度与对照组相比明显增大，经评估造模成功。至实验结束前，未出现动物死亡。

3.2 大鼠乳头直径、乳头高度及体质量比较 与对照组比较，模型组大鼠两侧乳头高度、直径明显增大，大鼠体质量明显降低（P＜0.05）；各治疗组大鼠经治疗后，乳头高度和直径较模型组显著减小（P＜0.05），大鼠体质量与模型组相比无明显差异（P> 0.05）；药物组大鼠乳头直径、药物加手法组乳头高度和直径与手法组相比改善更为明显（P＜0.05）；药物加手法组大鼠左侧乳头直径较药物组改善更为明显（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠乳头直径、乳头高度及体质量 （± s，n = 10）

表1 各组大鼠乳头直径、乳头高度及体质量 （± s，n = 10）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与手法组比较，▲P ＜0.05；与药物组比较，□P ＜0.05

组别 左侧乳头高度/mm 左侧乳头直径/mm 右侧乳头高度/mm 右侧乳头直径/mm 体质量/g对照组 1.376±0.222 0.767±0.080 1.381±0.235 0.766±0.056 242.410±21.105模型组 2.121±0.281# 1.185±0.103# 2.162±0.312# 1.155±0.126# 219.320±21.720#手法组 1.648±0.282#△ 0.905±0.107#△ 1.626±0.277△ 0.920±0.137△ 234.340±17.652药物组 1.515±0.303△ 0.776±0.101△▲ 1.534±0.258△ 0.722±0.064△▲ 234.090±21.818药物加手法组 1.345±0.307△▲ 0.649±0.103△▲□ 1.374±0.297△▲ 0.668±0.079△▲ 227.280±17.677

3.3 大鼠乳腺组织病理形态学观察 HE 染色结果可见，对照组大鼠乳腺组织中乳腺小叶未见明显增生，腺泡较少，导管未见明显扩张，个别导管内可见少量分泌物；模型组大鼠乳腺组织中部分乳腺小叶增生，腺泡增大，部分导管腔扩张，导管上皮细胞增生，可见较多分泌物；与模型组比较，手法组和药物组病变改善不明显；药物加手法组乳腺增生小叶减少，乳腺导管扩张减轻，导管内分泌物减少，见图1。

图1 各组大鼠乳腺组织病理形态（HE，×200）

3.4 大鼠血清中E2、P 含量比较 ELISA 结果可见，与对照组比较，模型组大鼠血清中E2含量显著升高（P＜0.05），P 的水平明显降低（P＜0.05）；手法组大鼠血清中E2、P 的含量变化与模型组相比改善不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），药物组和药物加手法组大鼠血清中E2水平较模型组均明显降低（P＜0.05），P 的含量明显升高（P＜0.05）；药物加手法组血清中E2、P 的含量变化与手法组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清中E2、P 含量（± s，n = 10）

表2 各组大鼠血清中E2、P 含量（± s，n = 10）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与手法组比较，▲P ＜0.05

组别 E2/（pg/mL） P/（ng/mL）对照组 18.612±3.237 3.985±1.742模型组 29.334±1.933# 0.985±0.418#手法组 27.928±2.271# 1.189±0.679#药物组 24.559±2.889#△ 1.913±0.710#△药物加手法组 22.428±4.169△▲ 2.942±1.489△▲

3.5 大鼠乳腺组织中ERα、PR 的蛋白表达 与对照组比较，模型组大鼠乳腺组织中ERα 的蛋白表达明显上调（P＜0.05），PR 的表达明显下调（P＜0.05）；药物加手法组较模型组显著下调了ERα 的表达（P＜0.05），上调了PR 的表达（P＜0.05），药物组较模型组上调了PR 的表达（P＜0.05）；手法组与模型组比较，ERα、PR 的表达无明显变化（P＞0.05），药物加手法组与手法组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3，图2。

图2 各组大鼠乳腺组织ERα、PR 的蛋白表达

表3 各组大鼠乳腺组织ERα、PR 的蛋白表达（± s，n = 6）

表3 各组大鼠乳腺组织ERα、PR 的蛋白表达（± s，n = 6）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与手法组比较，▲P ＜0.05

组别 ERα PR对照组 0.436±0.041 0.824±0.039模型组 0.892±0.032# 0.403±0.050#手法组 0.813±0.054# 0.502±0.064#药物组 0.725±0.061#△ 0.594±0.062#△药物加手法组 0.569±0.045△▲ 0.718±0.036△▲

4 讨论

乳腺增生症（mammary gland hyperplasia, MGH）是以乳腺导管和小叶结构紊乱，乳腺组织良性增生为主要表现的女性常见病[5]。近年来，随着生活节奏的加快，其发病率明显升高，且呈年轻化趋势发展。现代医学针对乳腺增生尚无理想治疗方案，目前多采用激素类药物及手术治疗[6-7]。以三苯氧胺为主的抗雌激素药物对乳腺增生具有较好的近期疗效，但长期应用容易加重患者内分泌紊乱，且停药后易复发；手术疗法亦存在术后易复发的问题，且治疗费用较高，患者多出现手术相关并发症[8]。中医外治法不良反应小，远期疗效好，且价格低廉，在乳腺增生的非手术治疗中具有很大优势。

中医学将乳腺增生归属为“乳癖”范畴，认为其病位在肝、脾、肾，发病机理以肾气不足，冲任失调为本，肝脾郁结，气滞、痰凝、血瘀凝滞为标，治宜调节冲任，疏肝健脾，化痰散结，畅通经络[9]。循经推拿手法是一种以经络理论为基础的外治手段，通过推揉按摩经穴激发经络气机，起到疏通经络，行气运血的作用，在临床应用中对胸腹、腰背痛，泄泻，便秘，月经不调等症均有显著疗效[10-11]。乳房被称为“宗经之所”，周围经络纵横，多条经脉汇集于此[12]，其中足厥阴肝经布于两胁，环绕乳头而行；足太阴脾经络胃，上膈，散布胸胁，行至乳头之外；足少阴肾经贯肝膈，其支脉入胸中，故循经按摩以足三阴经为主，所谓“经脉所过，主治所及”[13]。冲任二脉同起于胞中，冲脉与足少阴经并行向上而布于胸中，任脉行于两乳之间，乳房的生理病理状态直接受此二脉经气盈亏的调节；督脉行于背脊正中，为“阳脉之海”，任脉为“阴脉之海”，二脉通调则全身气血通畅，百脉皆通[14]。此外，手三阴经分布于上肢及腋窝，过胸部乳头外侧，肝有邪常客于两腋，通过手法作用于此三脉亦可达到疏肝散结之效[15]。

本研究采用外源性激素注射法建立乳腺增生大鼠模型，应用循经通络推拿手法作用于大鼠足三阴、手三阴经、任脉、督脉和乳房部，在此基础上结合常规西药三苯氧胺治疗，观察单纯手法、单纯药物及手法加药物治疗对乳腺增生大鼠的疗效。乳腺增生大鼠表现为乳房和乳头直径增大，通过精密游标卡尺测量乳头高度和直径可直观反映大鼠乳腺增生程度[16]。实验结果显示，各治疗组大鼠乳头直径、乳头高度较模型组均有显著改善，其中手法加药物组效果最佳，较手法组改善更为明显，与药物组无异。病理染色结果可见，药物加手法组大鼠乳腺增生程度较模型组明显减轻，而药物组和手法组病变改善不明显，提示手法推拿联合药物的治疗效果优于单纯手法和单纯药物治疗。乳腺增生的发病原因与E2、P 及其受体的水平变化密切相关[17-18]。E2是由卵巢所分泌的机体最重要的性激素，乳腺组织的正常发育及其功能受到E2的调控[19]。其与乳腺组织上的ER 结合，在正常分泌时促进乳腺组织发育，而过量表达的E2则可通过雌激素受体α（ERα）的介导刺激乳腺上皮增生，使乳腺导管扩张，间质纤维增生，导致乳腺增生发生[20-22]。血清中E2的含量常作为临床判定乳腺增生治疗效果的重要指标[23-24]。本实验中模型组大鼠血清中E2含量显著升高，药物组和药物加手法组大鼠E2含量均明显降低，而手法组较模型组降低不明显。同时Western-blot 结果显示，模型组乳腺组织中 ERα 的蛋白表达明显增加，药物组、药物加手法组显著下调了ERα 表达，而手法组下调不明显。另一方面，P 与E2间存在着相互拮抗作用。P 与其受体PR相结合，在正常分泌状态下促进乳腺小叶的发育，P 含量的降低可进一步促使E2的大量分泌，使乳腺增生加重[25-26]。模型组大鼠血清中P 的含量及乳腺组织中PR 的蛋白表达均显著降低，经治疗后，药物组和药物加手法组均明显上调了P 含量和PR 的蛋白表达，其中药物加手法组效果最佳，而手法组较模型组上升不明显。同样说明了循经通络推拿联合药物的治疗方法优于单纯手法和单纯西药治疗，能够调节乳腺增生大鼠体内激素水平来达到治疗目的。

循经通络推拿疗法作用于乳腺增生患者疗效明显，通过前期研究发现，其临床治愈率为80%，总有效率达100%[27]。本实验中单纯应用推拿手法治疗虽能一定程度地改善乳腺增生大鼠病变程度，但在病理和分子水平上未见明显作用，而当手法结合药物治疗时发挥了协同作用，对乳腺增生的改善效果最佳。其原因可能与推拿疗法显效较慢，需长期坚持相关。三苯氧胺用于乳腺增生疗效显著，但存在停药后易于复发的缺点，而推拿疗法的远期疗效普遍优于西药治疗，本实验结果提示循经推拿配合三苯氧胺内外结合治疗，其效果与单纯应用三苯氧胺、单纯推拿治疗相比更为明显，为中西医结合干预治疗乳腺增生提供了实验依据。