半夏白术天麻汤下调ApoE-/-小鼠TMAO代谢的作用研究

李继军,荣雅琪,孟宪卿,姜月华

血管炎性反应和脂质过氧化沉积导致的血管狭窄是动脉粥样硬化的主要病理改变。动脉粥样硬化在中医理论体系中无对应病名,根据其主要病理变化,多以眩晕、胸痹、痰饮为主进行辨证和对症治疗,总体属于本虚标实,以肝肾亏虚为本,以痰瘀阻滞为标。脾主运化,若饮食不节,劳逸失度,脾失健运,日久则脾虚湿盛,痰湿蕴结,阻于脉络,因此,治当燥湿化痰、平肝息风。

氧化三甲胺(TMAO),即三甲胺-N-氧化物(trimethylamineN-oxide),来源于肠道菌群对肉、蛋、奶等富含胆碱类食物的代谢,已证实血液循环TMAO水平与动脉粥样硬化风险呈正相关[1]。TMAO通过诱导脂肪酸转运体CD36表达上调,引起胆固醇过量沉积和泡沫细胞形成[2],且TMAO可激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性小体,导致内皮通透性增高和促炎性细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)等的释放,加重血管炎症反应[3],因此,TMAO近年来被视为是动脉粥样硬化的促进剂[4]。半夏白术天麻汤(BBTD)是治疗痰湿壅盛、风痰上扰的经典名方,功效化痰息风、健脾祛湿,由半夏、天麻、茯苓、橘红、白术、甘草组成,入选2018年国家中医药管理局《古代经典名方目录(第一批)》。半夏白术天麻汤临床多用于肥胖性高血压、颈源性眩晕、急性缺血性脑卒中、梅尼埃病等的治疗。有研究报道半夏白术天麻汤通过降血脂、下调基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达,改善载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠动脉粥样硬化[5]。本课题组既往研究证实,半夏白术天麻汤以剂量依赖性方式减少血管内皮细胞凋亡、改善内皮功能[6],改变了痰湿壅盛证小鼠的代谢模式,降低多种脂质循环水平,减少主动脉根部脂质沉积和斑块形成[7],且可下调肥胖性高血压大鼠肾脏CD36的表达[8]。但半夏白术天麻汤参与动脉粥样硬化的治疗及其机制仍有待研究,深入解读半夏白术天麻汤的血管保护机制具有重要的研究价值和临床意义。本研究通过检测半夏白术天麻汤干预后ApoE-/-小鼠血浆TMAO及相关代谢物水平的变化,并同步观察主动脉CD36、NLRP3的表达及NLRP3下游IL-1β、IL-18表达,探讨半夏白术天麻汤改善动脉硬化的药理作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型诱导

无特定病原体(SPF)级6周龄雄性ApoE-/-小鼠36只,体质量(22±2)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证编号:SCXK(京)2016-0006。动物房设置12 h∶12 h明暗周期,小鼠自由摄食、饮水,环境温度20～22 ℃,相对湿度60%。以标准饲料适应性喂养5 d后,高脂高胆固醇饲料喂养12周诱导动脉粥样硬化模型,然后分为半夏白术天麻汤组[17.8 g/(kg·d)]、瑞舒伐他汀钙组[0.08 mg/(kg·d)]和ApoE-/-模型组,每组12只,并以相应药物灌胃8周,灌胃期间仍继续高脂高胆固醇饮食。另以同周龄标准饲料喂养的12只C57BL/6J小鼠作为C57正常对照组。高脂高胆固醇饲料配方:83.75%基础饲料,21%脂肪,0.15%胆固醇[3],标准饲料和高脂高胆固醇饲料均购自北京科澳协力饲料有限公司。

1.2 药物

半夏白术天麻汤组方:半夏 9 g,天麻6 g,白术18 g,橘红6 g,茯苓6 g,甘草3 g,生姜5 g,大枣两枚。购自山东中医药大学附属医院中药房,水煎2次,2次水煎液混合后浓缩至生药1 g。

1.3 实验仪器及试剂

质谱系统为美国AB Sciex公司的4000Qtrap质谱检测系统,配有电喷雾(ESI)离子源和Analyst 1.6.2工作站;超高效液相色谱仪为Waters UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)液相色谱柱,Waters公司;Analyst软件(版本号:1.6.2),美国AB Sciex公司;酶标仪Labsystems Multiskan MS 352,芬兰赛默飞公司;洗 板 机Labsystems AC8,芬兰热电公司;TYXH-I漩涡振荡器,上海汗诺仪器有限公司;TGL-16MS台式高速冷冻离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司。兔抗小鼠 CD36 多克隆抗体(18836-1-AP)、兔抗小鼠NLRP3多克隆抗体(19771-1-AP),武汉三鹰公司;山羊抗兔多克隆抗体(ZB-2301),北京中衫金桥公司;链霉亲和素-生物素(SABC)免疫组化试剂盒(SP-0023),北京博奥森公司;3,3′二氨基苯胺(DAB)显色试剂盒(ZLI-9031),北京中衫公司;小鼠IL-1β酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(210304KE10)、IL-18 ELISA试剂盒(210304KE14),江苏晶美生物科技有限公司。水合氯醛,北京索莱宝科技有限公司。甲醇、甲酸、水、乙腈均购自CNW公司,L-2-氯苯丙氨酸购自上海恒创生物科技有限公司,LysoPC17.0购自美国Avanti公司。所有化学药品和溶剂均为分析纯或色谱级。

1.4 样本采集

每天观察记录小鼠一般情况。喂养20周后,10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,下腔静脉取血,EDTA抗凝,3 500 r/min离心10 min分离血浆,ELISA检测IL-1β、IL-18含量;并超高效液相色谱-电喷雾离子化串联质谱联用(UPLC-ESI-MS/MS)靶向检测血浆左旋肉碱(L-CA)、甜菜碱(Bet)、胆碱(CHO)、肌酐(Cre)、三甲胺(TMA)、TMAO的水平。冰上分离胸主动脉,10%中性甲醛固定,石蜡包埋,切片厚度4 μm,苏木素-伊红(HE)染色观察组织学改变,马松染色(Masson)观察细胞外基质中的胶原沉积从而评价组织纤维化程度;并免疫组化观察CD36、NLRP3的分布。

1.5 标准液的配制与血浆样品前处理

超纯水分别溶解左旋肉碱、甜菜碱、胆碱、肌酐、三甲胺、TMAO等各标准品至1 mg/mL作为储备液,依次稀释至1、2、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL。80 μL血浆加入240 μL甲醇-乙腈=2∶1(V/V)[含0.01 mol/L 2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)]涡旋混匀,超声振荡5 min,-20 ℃静置30 min,10 000 r/min离心15 min,取上清240 μL,挥干,加入200 μL甲醇-水=2∶98(V/V)涡旋混匀,超声1 min,加入200 μL氯仿4 ℃静置10 min,10 000 r/min离心5 min,取上清160 μL进样。

1.6 UPLC-ESI-MS/MS靶向检测TMAO系列代谢物的条件与数据分析

采用电喷雾离子源,正离子扫描,多反应检测(MRM)模式进行分析,优化正离子模式优化去簇电压(DP)、碰撞电压(CE)、碰撞室射出电压(CXP)等质谱参数(见表1),质谱分析条件:气帘气35;离子喷雾电压5 500 V;温度 550 ℃;离子源Gas 1∶35;Gas 2∶30。色谱流动相A(0.1%甲酸-水溶液),流动相B(乙腈),流速0.3 mL/min;梯度洗脱程序见表2。利用Analyst软件,采用默认参数对各MRM transition进行自动识别和积分,以质谱峰面积为纵坐标、物质浓度为横坐标绘制线性回归标准曲线。将样品分析物的质谱峰面积代入线性方程中,计算浓度。

表1 质谱参数

表2 梯度洗脱程序

1.7 免疫组化观察主动脉CD36、NLRP3的表达与分布

小鼠胸主动脉切片脱蜡至水,枸橼酸盐缓冲液微波炉高火加热进行抗原修复。然后滴加 3% H2O2室温孵育10 min,山羊血清室温封闭 30 min,分别滴加兔抗小鼠 CD36、NLRP3一抗(1∶200 稀释)4 ℃孵育过夜,磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照,次日依次滴加羊抗兔IgG二抗、SABC,DAB显色,苏木素复染3 min,显微镜下观察棕黄色颗粒沉积作为阳性。随机选取5个视野,以Image J软件进行半定量分析。

1.8 ELISA检测血浆IL-1β、IL-18含量

依据ELISA试剂盒说明书操作,检测血浆IL-1β、IL-18含量。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 主动脉形态

各组小鼠胸主动脉HE染色显示,C57正常对照组主动脉细胞排列有序,管壁光滑,内-中膜厚度适中;ApoE-/-模型组主动脉平滑肌层细胞排列紊乱,细胞核浓染,内-中膜间可见脂质沉积导致的空泡和组织异常,细胞外基质中可见大量胶原沉积;应用半夏白术天麻汤和瑞舒伐他汀钙后,脂质空泡显著减少,胶原沉积减轻,血管结构、形态有明显的改善。详见图1。

图1 小鼠胸主动脉HE及Masson染色切片图

2.2 血浆TMAO及相关代谢物水平的靶向UPLC-ESI-MS/MS检测

ApoE-/-模型组血浆左旋肉碱、甜菜碱、肌酐、三甲胺、TMAO水平高于C57正常对照组(P<0.05或P<0.01);半夏白术天麻汤和瑞舒伐他汀钙干预后,均能降低左旋肉碱、甜菜碱、肌酐、三甲胺、TMAO水平,与ApoE-/-模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);但半夏白术天麻汤组血浆胆碱水平高于ApoE-/-模型组及瑞舒伐他汀钙组(P<0.01)。详见图2、表3。

图2 各组UPLC-ESI-MS/MS血浆TMAO及相关代谢物水平比较

表3 各组血浆TMAO及相关代谢物水平比较(±s) 单位:ng/mL

2.3 主动脉CD36、NLRP3的分布

ApoE-/-模型组主动脉的CD36、NLRP3分布多于C57正常对照组主动脉(P<0.01);与ApoE模型组比较,半夏白术天麻汤组和瑞舒伐他汀钙组主动脉的CD36、NLRP3分布降低(P<0.01),半夏白术天麻汤组和瑞舒伐他汀钙组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图3、图4。

图3 免疫组化观察小鼠主动脉CD36、NLRP3的切片图

图4 免疫组化观察小鼠主动脉CD36、NLRP3分布柱状图

2.4 血浆IL-1β、IL-18含量

ApoE-/-模型组血浆IL-1β、IL-18高于C57正常对照组(P<0.01);与ApoE-/-模型组比较,半夏白术天麻汤组和瑞舒伐他汀钙组血浆IL-1β、IL-18浓度降低(P<0.01),半夏白术天麻汤组和瑞舒伐他汀钙组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表4。

表4 各组血浆IL-1β、IL-18含量比较(±s) 单位:ng/L

3 讨 论

半夏白术天麻汤是专于化痰湿、息内风的经典方药[9],源于李东垣的《脾胃论》,经清代名医程国彭加减形成现在的组方形式。据纳入112 458例眩晕病人、随访15年的真实世界研究发现,半夏白术天麻汤不仅缓解了眩晕的临床症状,还有效降低了眩晕病人的卒中风险,其药效优于苓桂术甘汤和天麻钩藤饮[10]。据纳入1 424例高血压病人的Meta分析证实,半夏白术天麻汤可有效降低收缩压,半夏白术天麻汤联合西药的降压药效明显优于单独西药治疗,使病人得到更大获益[11]。另据纳入2 796例椎-基底动脉供血不足病人的Meta分析,半夏白术天麻汤提高了左椎动脉、右椎动脉、基底动脉的血流速度,减少了短暂性脑缺血(TIA)发作次数[12]。虽以上研究均未对其药理机制进行阐释,但通过分析半夏白术天麻汤的临床适应证,提示半夏白术天麻汤可改善动脉粥样硬化这一共同致病因素,从而实现其治疗高血压、眩晕、TIA,降低脑卒中风险的药效,因此,对半夏白术天麻汤药理机制的探索具有重要的临床意义。本课题组既往研究证实,半夏白术天麻汤可有效改善氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管内皮功能紊乱[6],降低多种循环脂质水平,并减少脂质沉积于大动脉[7]。半夏白术天麻汤健脾祛湿,尤擅治疗代谢相关的心脑血管疾病,但其调节代谢的机制和靶标仍亟待深入研究。

TMAO是独立于传统心血管危险因素及心肾功能的新型代谢小分子指标,TMAO水平不仅与动脉粥样硬化风险呈正相关,而且与脑钠肽水平也具有相关性,高TMAO水平提示心因性死亡风险增加[13]。因肉碱、甜菜碱、胆碱均是TMAO的前体物质,在肠道菌群作用下转化为三甲胺,继而在肝脏黄素单加氧酶(FMOs)的作用下可转化为TMAO,血浆中的胆碱、甜菜碱、左旋肉碱升高预示着不良心血管事件的风险增加[14]。本研究中,半夏白术天麻汤降低了ApoE-/-小鼠血浆左旋肉碱、甜菜碱、肌酐、三甲胺、TMAO水平,显示出强大的改善动脉粥样硬化相关代谢物的作用。令人意外的结果是,半夏白术天麻汤组血浆胆碱水平高于其他3组,胆碱作为磷脂的组分,是生物膜的重要组成成分,也是迷走神经递质乙酰胆碱的前体分子[15],提示半夏白术天麻汤以更为复杂的方式调节胆碱水平,参与心血管疾病过程。

TMAO是CD36和NLRP3的内源性配体[16]。巨噬细胞通过CD36介导的内吞途径,促进可溶性ox-LDL的摄取,导致溶酶体破裂和NLRP3炎症小体的活化[17]。NLRP3炎症小体广泛存在于单核-巨噬细胞中,TMAO激活NLRP3炎症小体后,导致单核-巨噬细胞集聚活化,促进IL-1β、IL-18的成熟和释放,在非感染情况下引发和维持慢性炎症反应,参与心血管炎症过程及动脉粥样硬化的发生发展,增加心脑血管事件风险。在本研究中,应用半夏白术天麻汤后,ApoE-/-小鼠在主动脉CD36、NLRP3分布减少的同时,IL-1β、IL-18水平也随之降低,提示机体炎症水平的下调。

本研究证实,半夏白术天麻汤调节TMAO代谢途径,减少胆固醇蓄积、泡沫细胞形成和血管炎症,从而改善ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化。已知肠道菌群是肉碱、甜菜碱、胆碱转化为TMAO的关键因素,提示半夏白术天麻汤与肠道菌群的关系也是今后的研究方向。