UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS法分析 补肾降浊颗粒的化学成分
2023-10-12顾雪晶李艳丽朱圆瑛康立圆
顾雪晶,孙 正,郝 腾,李艳丽, 2,朱圆瑛,吴 燕,康立圆,许 卉
(1.烟台大学药学院,山东 烟台 264005;2.滨州市中医医院,山东 滨州 256601)
糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病最严重的慢性并发症之一,大约30%～40%的糖尿病患者会出现肾脏疾病,临床上以持续性白蛋白尿、肾小球滤过率进行性下降为主要特征,同时增加了患者患高血压和心血管疾病的风险[1]。中医认为DN多因气阴两虚、肾气不固导致淤阻经脉,治疗需以补肾固精、益气活血为治疗原则[2-3],而补肾降浊颗粒具有补肾降浊、活血通络的功效。补肾降浊颗粒是在经典名方六味地黄丸基础上结合临床经验加味而成的院内中药制剂[4],经过临床反复实践,治疗DN疗效确切,有利于延缓DN发病进程。
中药复方制剂成分十分复杂,发挥药效不是单一成分的简单加和,而是多成分协同起效[5-6],因此,同时检测尽可能多的化学成分至关重要。目前,补肾降浊颗粒的化学成分研究未见报道,而超高效液相色谱四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术(UPLC-Q-Orbitrap-HRMS)具有高选择性、高灵敏度、高准确度等优势,被广泛应用于中药复方物质基础研究[7-8]。本研究首次利用质谱联用技术对补肾降浊颗粒的化学成分进行快速分离鉴定,为进一步研究药效物质基础及质量控制提供参考。
1 材 料
Thermo Scientific 高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔科技公司),Exactive 四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(美国赛默飞世尔科技公司),XS-105型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO),TGL-20W型台式高速冷冻离心机(上海湘仪实验室仪器开发有限公司),SK250HP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司),补肾降浊颗粒(批号20220212,滨州市中医院),甲醇、乙腈均为色谱纯(美国默克公司),娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。
2 方 法
2.1 检测条件
2.1.1 色谱条件 色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),流动相:0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～4 min 2% B,10～18 min 10%～25% B,35～47 min 45%～60% B,47～55 min 60%～90% B,55～60 min 90% B,60.1～64 min 2% B),流速:0.3 mL/min,柱温:40 ℃,进样量:2 μL。
2.1.2 质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI),在正、负离子模式下分别进行检测,扫描范围:m/z80～1200,鞘气流速:50 L/min,辅助气流速:10 L/min,喷雾电压:3500 V,辅助器温度:350 ℃,离子化电压:5500 V,碰撞能量:20、40、60 eV。
2.2 溶液制备
取补肾降浊颗粒适量,研细,取约2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇溶液40 mL,密塞,称定重量,超声处理30 min,再次称重,用甲醇溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,过0.22 μm滤膜,即得。
2.3 数据分析
采用Thermo Xcalibur 4.0软件进行数据采集,根据高分辨质谱提供的准分子离子和加合离子等信息推测并得到精确相对分子质量,再由Xcalibar 4.0软件拟合计算分子式,与Compound discovery 3.2软件和本地自建数据库相匹配,依据化合物数据库及国内外文献报道的信息,确认化学成分及结构。
3 结 果
采用UPLC-Q-Orbitrap-HRMS方法对补肾降浊颗粒的化学物质组成进行快速分析,按“2.1”项下的色谱和质谱条件,分别进行正、负离子模式扫描,采集得到正、负离子模式下的色谱图,结果如图1所示。针对质谱中得到的准分子离子和特征碎片离子信息,结合文献进行分析,推测了173个化合物,其中主要包括黄酮类、有机酸类、酚类、萜类等,结果汇总见表1。分别选取各结构类型的代表性成分,根据一级和二级质谱数据,对化合物进行鉴定,分析化合物裂解方式。
表1 补肾降浊颗粒中的化学成分
3.1 黄酮类化合物裂解途径分析
图2 芒柄花苷二级质谱图和裂解途径
3.2 有机酸类化合物裂解途径分析
共鉴别出有机酸类化合物36个,以化合物金鸡纳酸为例,在正离子模式下经一级质谱扫描得准分子离子峰m/z192.057 9 [M+H]+,预测其分子式为C7H12O9,二级质谱图显示m/z173.008 4、145.049 7、129.0544、111.007 4、85.028 0。通过计算可以归属得到的碎片离子,准分子离子失去一个COOH,得到碎片离子m/z145.049 7 [M+H-COOH]+;随后失去一个OH得到碎片离子m/z129.054 4 [M+H-COOH-OH]+;再失去一个OH,得到基峰碎片离子m/z111.007 4 [M+H-COOH-OH-OH]+;准分子离子失去一个H2O,得到碎片离子峰m/z173.008 4 [M+H-H2O]+;随后再失去一个COOH,一个OH,一个C—O,得到碎片离子峰m/z85.028 0 [M+H-COOH-CHO2]+。根据以上碎片离子信息,推测该化合物为金鸡纳酸,其二级质谱图及可能的质谱裂解途径见图3。
图3 金鸡纳酸二级质谱图和裂解途径
3.3 萜类化合物裂解途径分析
共鉴别出萜类化合物45个,以化合物丹参酮ⅡA为例,在正离子模式下经一级质谱扫描得准分子离子峰m/z295.132 2 [M+H]+,预测其分子式为为C19H18O3,二级质谱图显示m/z280.168 9、262.098 1、249.126 4、184.075 3、81.070 3。通过计算可以归属得到的碎片离子,准分子离子失去一个CH3,得到碎片离子m/z280.168 9 [M+H-CH3]+;随后失去C5H2O4,得到基峰碎片离子m/z184.075 3 [M+H-C5H2O4]+;再失去一个C8H7,得到碎片离子m/z81.070 3 [M+H-C5H2O4-C8H7]+;准分子离子失去一个H2O和一个CH3,得到碎片离子m/z262.098 1 [M+H-H2O-CH3]+;再失去一个H2O和一个C—O,得到碎片m/z249.126 4 [M+H-H2O-CO]+。根据以上碎片离子信息,推测该化合物为丹参酮IIA,其二级质谱图及可能的质谱裂解途径见图4。
图4 丹参酮ⅡA二级质谱图和裂解途径
3.4 酚类化合物裂解途径分析
共鉴别出酚类化合物18个,以化合物白皮杉醇为例,在负离子模式下经一级质谱扫描得准分子离子峰m/z243.065 9 [M-H]-,预测其分子式为C14H12O4,二级质谱图显示m/z226.055 7、135.048 3、121.028 1、109.028 1。通过计算可以归属得到的碎片离子,失去一分子的H2O,得到碎片离子m/z226.055 7 [M-H-H2O]-;失去C6H2O, 得到碎片离子m/z135.043 8 [M-H-H2O-C6H2O]-;再失去一个CH2,得到碎片离子m/z121.028 1 [M-H-H2O-C7H4O]-;再失去一个CH3,得到碎片离子m/z107.028 1 [M-H-H2O-C7H4O]-。根据以上碎片离子信息,推测该化合物为白皮杉醇,其二级质谱图及可能的质谱裂解途径见图5。
图5 白皮杉醇二级质谱图和裂解途径
3.5 糖和苷类化合物裂解途径分析
共鉴别出糖和苷类化合物21个,以化合物乙基-β-D-吡喃葡萄糖为例,在负离子模式下经一级质谱扫描得准分子离子峰m/z221.066 2 [M-H]-,预测其分子式为C8H14O7,二级质谱图显示m/z161.044 5、113.024 4、75.028 7。通过计算可以归属得到的碎片离子,准分子离子失去一个COOH和一个OH,得到碎片离子m/z161.044 5 [M-H-COOH-OH]-;失去C2H9O,得到碎片离子m/z113.024 4 [M-H-COOH-OH-C2H9O]-;失去C3H2,得到碎片离子m/z75.008 7[M-H-COOH-OH-C2H9O-C3H2]-。根据以上碎片离子信息,推测该化合物为乙基-β-D-吡喃葡萄糖,其二级质谱图及可能的质谱裂解途径见图6。
图6 乙基-β-D-吡喃葡萄糖二级质谱图和裂解途径
4 讨 论
目前已有多项关于补肾降浊药方中单味药材的研究,尚未有关于该复方颗粒中化学成分的报道。本研究采用的UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS技术,用于分析中药复方的复杂成分具有很大的优势,该技术结合了Q Exactive的高灵敏性和Orbitrap的高准确性[9-11],可以增加补肾降浊颗粒中化学成分的检出。对比正、负离子两种扫描模式,正离子模式下的质谱响应较强,但是不同化合物在不同扫描模式下响应不同[12-13],为获得全面的化合物信息,采用两种离子扫描模式以获得更全面的化合物信息。总离子流图可知出峰时间大多集中在35～55 min范围内。在建立色谱条件的过程中,选择梯度洗脱的目的是让样品中强保留组分也能被洗脱出来,该方法是组分复杂的样品常采用的洗脱方式[14]。为确定最佳的色谱条件,将10～18 min,45～60 min范围内的梯度变化加快,增加样品出峰数量,若使用比较缓慢的梯度会导致出峰较少、分离度差,而20～40 min范围内需要减慢梯度,以保证色谱峰的分离度,最终确定了最优的梯度洗脱条件。同时,在流动相中加入0.1%甲酸溶液可有效改善峰型和离子化效果。
5 结 论
本研究采用UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS技术,确定了最优的色谱和质谱条件,建立的检测方法用于补肾降浊颗粒的化学成分分析,高效、准确。总共鉴定出173个化学成分,正离子模式下鉴别出91个化合物,负离子模式下鉴别出82个化合物。首次明确了萜类、黄酮类、有机酸类化合物是补肾降浊颗粒的主要组成成分,从整体上明确了补肾降浊颗粒的化学成分,为进一步研究药效物质基础和质量控制提供了理论依据。
