基于JAK/STAT信号通路探讨痰瘀同治法对糖尿病大鼠心肌病变的影响

陈 静,储全根,,储 俊,轩 云,蔡正银,李飞翔,罗宝璐,王悦琦

(1.安徽中医药大学中医学院,安徽 合肥 230012;2.安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室,安徽 合肥 230038)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是并发于糖尿病的独立疾病,可引起心脏舒缩功能障碍、心肌肥厚、心肌纤维化,最终导致心力衰竭[1]。晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)是一种多模式识别受体,属于免疫球蛋白超家族,在高糖刺激下与晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)结合,激活多种相关信号通路,导致生长因子的转录和释放增加,加重心肌炎症及纤维化病变。酪氨酸蛋白激酶/信号转导与转录激活子(Janus-activated kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)信号通路对细胞增殖、分化、凋亡等具有重要作用[2],可通过调控趋化因子、黏附分子、生长因子等基因表达导致并加重DCM炎症及纤维化病变[3]。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一种炎症因子,其不仅参与机体的炎症反应,还与心肌纤维化及重构、器官的慢性损伤等有关。课题组前期研究[4]发现,痰瘀同治法对DCM大鼠心肌内皮细胞有保护作用,同时痰瘀同治法可有效干预糖尿病微血管病变[5]。为进一步探究痰瘀同治法时DCM的作用机制,本实验以具有化瘀功效的抵当汤和具有化痰功效的小陷胸汤合方(抵当陷胸汤)作为痰瘀同治法的代表方,观察痰瘀同治法对DCM大鼠心肌组织JAK/STAT信号通路的影响。

1 材料

1.1 动物 清洁级SD雄性大鼠55只,体质量为(220±20)g,鼠龄约12周,购自安徽医科大学实验动物中心[生产许可证号:SCXK(皖)2020-001]。实验严格按照安徽中医药大学实验动物中心实验动物保护与使用准则进行。在自然光照、湿度45%～55%、温度25 ℃左右环境下饲养1周后进行分组处理。本实验获安徽中医药大学伦理委员会审批,批号: AHUCM-rats-2019014。

1.2 药物 痰瘀同治组采用抵当陷胸汤(全瓜蒌30 g,桃仁15 g,水蛭、虻虫、制大黄、清半夏各10 g,黄连5 g);化痰组采用小陷胸汤(全瓜蒌30 g,清半夏10 g,黄连5 g);化瘀组采用血府逐瘀汤(桃仁12 g,红花、当归、生地黄、牛膝各9 g,甘草、赤芍、枳壳各6 g,桔梗、川芎各4.5 g,柴胡3 g)。药材采购于安徽中医药大学国医堂,经安徽中医药大学药学院金传山教授鉴定符合《中华人民共和国药典》[6]要求。煎煮方法:用10倍的水将中药浸泡后,煎煮2次后将滤液合并,以文火煎煮药液直到浓缩至含生药质量浓度为1 g/mL,将浓缩后的药液装入瓶中,在-80 ℃冰箱冷冻后,制备冻干粉,保存备用。阿拉氯胺(alagebrium chloride, ALT-711)由美国Med Chem Express公司生产,每支50 mg,批号HY-106024B。

1.3 主要试剂 链脲佐菌素(streptozotocin, STZ;批号 S17049):美国Sigma公司;p-JAK1(货号 bs-3238R,批号 AG11139224)、PPARγ(货号 bs-4590R,批号 98080w)、TGF-β1(货号 bs-0086R,批号 AD112007):北京博奥森生物技术;RAGE(货号 ab3611,批号 GR3191187-3)、p-STAT1(货号 ab109461,批号 GR311501-5):英国Abcam公司;Tris(货号 T8060,批号 1117W0713):北京索莱宝科技;PVDF膜(货号 IPVH00010,批号 R8CA8257E):美国Millipore公司;Western一抗二抗去除液(货号 P0025,批号 051418180626):上海碧云天生物技术;β-actin(货号 TA-09,批号 18AV0311):上海金畔生物科技;基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein,MMP9;货号 JYM0434Ra,批号 GR2022-10)、纤连蛋白(fibronectin,FN;货号 JYM0659Ra,批号 GR2022-10):武汉基因美科技。

1.4 主要仪器设备 RM2016切片机:德国徕卡;ACCU-CHEK Active血糖仪:德国罗氏;EPS300电泳仪:上海天能;CX41显微镜:日本OLYMPUS;PIKOREAL96荧光定量PCR仪:美国Thermo Scientific;RT-6100酶标仪:深圳雷杜。

2 方法

2.1 模型复制 将55只健康雄性SD大鼠适应性喂养7 d后,随机选取10只作为空白组,剩余45只进行模型复制。大鼠禁食不禁水12 h后,按55 mg/kg腹腔注射STZ溶液。72 h后,采用尾静脉法测大鼠随机血糖,若随机血糖>16.7 mmol/L,则符合糖尿病模型标准[7]。前期研究[8-9]发现,继续饲养3周后大鼠心肌组织会呈现细胞肥大、心肌纤维断裂并伴有炎症细胞浸润等病理改变,提示DCM模型复制成功。

2.2 动物分组与给药 将模型复制成功的40只大鼠用随机数字表法分为模型组、化瘀组、化痰组、痰瘀同治组、ALT-711组。按照人与大鼠的给药剂量换算系数[10]计算,空白组和模型组每日均按10 mL/kg蒸馏水灌胃;化瘀组、化痰组与痰瘀同治组每天分别以血府逐瘀汤(7.02 g/kg)、小陷胸汤(4.05 g/kg)、抵当陷胸汤(8.10 g/kg)灌胃;ALT-711组以ALT-711 (3 mg/kg)灌胃。给药8周后,采用3%戊巴比妥钠30 mg/kg进行腹腔注射,大鼠麻醉后取心肌组织。

2.3 Western blot法检测RAGE、PPARγ、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1蛋白表达水平 取冻存心肌组织50 mg,在冰上剪碎放入试管,加入RIPA细胞裂解液1 mL,离心后提取蛋白。上样后,恒流转膜(RAGE转膜45 min,PPARγ转膜60 min;p-JAK1转膜140 min;p-STAT1转膜90 min;TGF-β1转膜60 min)。转膜结束用5%脱脂奶粉室温封闭2 h,参考一抗的说明书:RAGE、PPARγ、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1抗体属性为兔抗,分别按照1∶1 000、1∶300、1∶300、1∶5 000、1∶1 000稀释(10%分离胶),4 ℃缓慢摇动孵育过夜,洗3次,参考二抗的说明书,按照1∶10 000加入二抗稀释液稀释,室温2 h后用JS-1070P自动曝光仪检测RAGE、PPARγ、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1蛋白表达水平。

2.4 PCR法检测RAGE、PPARγ基因的表达水平 将每组取出的冻存心肌组织50 mg倒入液氮研磨后,加入TRIzol总RNA抽提试剂1 mL,冰浴匀浆后,按说明书提取总RNA,每组取1 μg RNA逆转录为cDNA;以β-actin为内参,按照说明书进行PCR检测。PCR反应条件:预变性温度为95 ℃,时间60 s;变性温度95 ℃,时间20 s,退火温度60 ℃,时间60 s,40个循环。计算方法是2-ΔΔCT。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.5 ELISA法检测心肌组织FN、MMP9含量 取冻存的心肌组织,加入一定量的PBS,充分匀浆后离心,取上清液。严格按照试剂盒说明书操作,用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度,通过标准曲线计算样品浓度。

3 结果

3.1 各组大鼠心肌组织中RAGE、PPARγ、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1蛋白表达水平比较 与空白组比较,模型组心肌组织中RAGE、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1蛋白表达水平均上升(P<0.05),PPARγ蛋白表达水平显著下降(P<0.05);与模型组比较,化瘀组、化痰组、痰瘀同治组及ALT-711组心肌组织中RAGE、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1蛋白的表达水平均升高(P<0.05),PPARγ蛋白表达水平降低(P<0.05);与化瘀组和化痰组比较,痰瘀同治组RAGE、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1蛋白表达水平显著下降(P<0.05),PPARγ蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图1、图2。

注:A.空白组;B.模型组;C.化瘀组;D.化痰组;E.痰瘀同治组;F.ALT-711组;

注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与化瘀组比较,△P<0.05;与化痰组比较,◇P<0.05

3.2 各组大鼠心肌组织中RAGE、PPARγ基因表达水平比较 与空白组比较,模型组心肌组织中RAGE基因表达水平显著上升(P<0.05),PPARγ基因表达水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,化瘀组、化痰组、痰瘀同治组及ALT-711组心肌组织RAGE基因表达水平显著下降(P<0.05),PPARγ基因表达水平显著升高(P<0.05);与化瘀组和化痰组比较,痰瘀同治组RAGE基因表达水平下降更显著(P<0.05),而PPARγ基因表达水平升高更显著(P<0.05)。见图3。

注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与化瘀组比较,△P<0.05;与化痰组比较,◇P<0.05

3.3 各组大鼠心肌组织中FN、MMP9含量比较 与空白组比较,模型组心肌组织FN、MMP9含量增加(P<0.05);与模型组比较,化瘀组、化痰组、痰瘀同治组及ALT-711组心肌组织FN、MMP9含量显著下降(P<0.05);与化瘀组和化痰组比较,痰瘀同治组FN、MMP9含量下降更显著(P<0.05)。见图4。

注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与化瘀组比较,△P<0.05;与化痰组比较,◇P<0.05

4 讨论

DCM病理改变包括炎症反应、糖脂代谢紊乱和信号传导异常等,这些会导致心肌肥大和心肌纤维化。RAGE是一种模式识别受体,在心肌细胞、免疫细胞中表达,RAGE具有多个配体,AGEs是RAGE重要的配体之一。JAK/STAT作为一种调节多种细胞因子基因的信号通路,被AGEs/RAGE激活后[11],磷酸化的JAK蛋白与STAT蛋白结合并转移到细胞核中,结合靶基因的启动子区域并调节转录。JAK家族中有4种亚型,JAK1的过表达会激活STAT1并将其转移到细胞核中调节基因表达,参与纤维化病变[12]。STAT1可以通过调节TGF-β1的表达参与心肌纤维化过程[13],同时,p-STAT1还能引起高糖下心肌成纤维细胞增殖和胶原沉积[14]。JAK/STAT信号通路对DCM具有重要作用,抑制该通路可以改善DCM大鼠心肌纤维化,减轻炎症反应与氧化应激反应[15-16]。本研究结果显示,模型组大鼠p-JAK1及p-STAT1蛋白表达增多,各用药组p-JAK1及p-STAT1表达水平降低,提示DCM大鼠心肌JAK/STAT信号通路被激活,而痰瘀同治组下调效果较化痰组和化瘀组更为明显,提示痰瘀同治法可以抑制JAK/STAT信号通路的表达,效果优于化痰组和化瘀组。PPARγ是一种与葡萄糖和脂肪酸代谢相关的关键转录调节剂,PPARγ能够降血糖并提高胰岛素的敏感性,目前已被用于治疗糖尿病改善心肌纤维化。据报道,PPARγ可以抑制AGEs诱导的心肌纤维化[17],活化的PPARγ不仅能降低RAGE的活性[18],还能通过直接与STAT1结合形成转录抑制性复合物,降低下游细胞因子的表达[19]。本研究结果显示,各用药组较模型组PPARγ表达水平升高,RAGE、p-JAK1、p-STAT1的表达水平降低,而痰瘀同治组效果较化痰组和化瘀组更明显,提示痰瘀同治法可能通过活化PPARγ并下调RAGE的表达来抑制JAK/STAT信号通路,以保护心肌减轻损伤。

心肌纤维化的重要特征是细胞外基质的沉积。TGF-β1是重要的促纤维化因子,可诱导细胞外基质的沉积,改变心肌胶原的纤维网状结构[20]。FN是细胞外基质的主要成分,与心肌纤维化密切相关,MMP9作为基质金属蛋白酶家族成员,其与抑制物的平衡被破坏会引起细胞外基质沉积,FN和MMP9表达会引起纤维化的发生,从而刺激TGF-β1增加FN、MMP9等表达,加重纤维化病变[21-22]。

本研究结果显示,模型组FN、TGFβ1、MMP9表达水平升高,而用药后表达水平降低,其中痰瘀同治组下调更明显,提示痰瘀同治法可降低FN、TGFβ1、MMP9表达水平,减少细胞外基质的沉积,减轻心肌纤维化病变。同时,JAK/STAT信号通路与MMP9、FN、TGFβ1等纤维化相关指标的表达密切相关[13,23-24]。综上,高糖状态下,AGEs与RAGE结合后激活JAK/STAT信号通路,促进TGF-β1、FN、MMP9的表达,加重DCM病变,而痰瘀同治法通过抑制JAK/STAT信号通路,减少TGF-β1、FN、MMP9的表达,减轻心肌纤维化病变。

DCM属于中医“消渴”伴有“胸痹”的范畴。发生DCM时,AGEs不断积累并与其受体RAGE结合激活JAK/STAT通路,引起心肌微血管受损、细胞外基质沉积和纤维化等病理改变,同时这些改变亦进一步导致AGEs的沉积。AGEs是由非酶反应而生成的聚合物,具有“痰浊”特征,AGEs积累导致胶原蛋白沉积及纤维化等病理改变,又符合“瘀阻”特征[25],故形成“痰瘀互结”病机,“痰”与“瘀”相互交结,难以独除。正如《血证论》的描述:“有痰必有瘀,有瘀必有痰,痰阻血难行,血瘀痰难化。”可见化痰和化瘀需同时施治,故本课题组以痰瘀同治法为防治思路,使用抵当陷胸汤防治DCM。抵当陷胸汤是由中抵当汤与小陷胸汤合方而成,抵当汤中水蛭、虻虫同用共行破血逐瘀通络之功,酒大黄、桃仁化瘀行血;小陷胸汤中黄连清热燥湿、泻火解毒,半夏化痰,二者相配辛开苦降,以全瓜蒌涤痰宽胸。本实验结果表明,给药8周以后,与模型组比较,化瘀组、化痰组、痰瘀同治组及ALT-711组RAGE、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1、FN、MMP9表达水平降低,而PPARγ的表达水平升高,提示各组对JAK/STAT信号通路及RAGE、TGF-β1、FN、MMP9有抑制作用,并活化PPARγ。痰瘀同治组较化痰组、化瘀组效果明显,可见其对RAGE、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1、FN、MMP9表达水平的下调和对PPARγ的活化效果更明显。本研究结果表明,痰瘀同治的抵当陷胸汤通过抑制DCM大鼠JAK/STAT信号通路,减轻纤维化相关指标的表达,改善DCM病变,且作用效果优于单纯的化痰组及化瘀组。

综上所述,痰瘀同治法对DCM大鼠心肌病变具有保护作用,其机制可能与抑制JAK/STAT信号通路有关,并且痰瘀同治法效果优于单纯的化痰和化瘀法。