电针对慢性不可预见性温和应激致抑郁小鼠海马氧化应激-calpain-炎症信号轴的影响

陈 赟,杜坤锐,王婧吉,杨晨曦,杨义萍,王 娟,张闻东

(1.安徽中医药大学第二附属医院,安徽 合肥 230061;2.安徽省中医药科学院针灸临床研究所,安徽 合肥 230061;3.安徽中医药大学研究生院,安徽 合肥 230012)

抑郁是一种复杂的异质性精神系统疾病,发病率高且呈现年轻化的趋势[1-2]。目前,抗抑郁治疗药物以5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)再摄取抑制剂为主,然而该类药物具有起效缓慢、不良反应大的缺点,导致部分患者中途停止服药[3]。抑郁的发病机制复杂,其中氧化应激损伤、炎症反应以及突触损伤被认为是抑郁发生的重要机制[4]。有研究[5]表明,抑郁自杀患者脑组织表现出过度的氧化应激损伤和炎症反应。而氧化损伤能促进钙离子依赖的蛋白降解酶calpain的功能[6]。通过复制小鼠抑郁模型,Shen等[7]报道了氧化应激-calpain-炎症信号轴在抑郁发生过程中的关键作用,该信号轴抑制氧化性损伤或calpain的功能可以改善抑郁样行为。

电针疗法可有效缓解抑郁患者和模型动物的抑郁样行为[8-9],且该疗法具有安全性高和不良反应小等优势,已在全球多个国家用于治疗抑郁[10]。“百会-神门-三阴交”是针灸临床报道中治疗抑郁采用较多的组穴[11-12],也是本团队依据中国针灸学会《循证针灸临床实践指南》方案治疗抑郁的常用处方。然而针刺“百会-神门-三阴交”组穴是否通过调控氧化应激损伤-calpain-炎症信号轴发挥抗抑郁的作用尚不清楚。本研究拟通过慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)抑郁模型,评价电针“百会-神门-三阴交”组穴的抗抑郁作用,以期从海马氧化应激-calpain-炎症信号轴揭示其作用机制,为电针治疗抑郁的临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物 2月龄SPF级雄性C57BL/6小鼠48只,购于安徽医科大学实验动物中心,生产许可证号: SCXK(皖)2016-0009,体质量为20～25 g。进行实验前,按照以下条件给予动物适应性喂养1周:光周期为8:00～20:00,室内湿度为45%～65%,室温为20～24 ℃,自由饮水、进食。本实验已通过安徽中医药大学动物实验伦理审查委员会审批(审批号: AHUCM-mouse-20210205),动物处置、操作均参照中华人民共和国科学技术部于2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。

1.2 主要试剂 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性检测试剂盒(货号 BC0175)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量检测试剂盒(货号 BC0025):北京索莱宝;白细胞介素(interleukin,IL)-1β酶联免疫试剂盒(货号 JL18442)、5-HT酶联免疫试剂盒(货号 JL12087)、血清皮质酮(corticosterone,CORT)酶联免疫试剂盒(货号 JL11918):江莱生物。calpain-1(货号 2556S)、1L-1β(货号 12703S):美国Cell Signaling Technology。

1.3 主要仪器 脉冲针灸治疗仪(型号 KWD-808):常州英迪电子医疗器械有限公司;低温高速离心机(型号 Micro-21R):美国Thermo;电泳仪、转膜仪(型号 EPS 600):北京天能;全自动样品快速研磨仪(型号 JXFSTPRP-96):上海净信实业发展有限公司;酶标仪(型号 Synergy LX):美国Bio-Tek;一次性无菌针灸针(0.15 mm×13 mm):苏州医疗用品厂有限公司;电击箱(型号 40500-001):意大利 UgoBasile 公司。

2 方法

2.1 动物分组 CUMS模型复制时,采用随机数字表法将24只小鼠分为正常组、模型组、电针组和维生素C(vitamin C,VC)组,每组6只;为进一步揭示氧化应激-calpain-炎症信号轴在抑郁中的作用机制,研究按2 mg/kg剂量给予小鼠腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)复制小鼠急性抑郁模型[13]。将24只小鼠分为正常组、模型组、钙蛋白酶抑制剂(calpeptin inhibitor,CI)组和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)组,每组6只。

2.2 模型复制及干预措施

2.2.1 CUMS模型复制及干预措施 模型组、电针组和VC组小鼠自第2周至第7周给予14种刺激(禁食24 h,禁水24 h,浸湿垫料24 h,去除垫料24 h,倾斜鼠笼12 h,噪音刺激3 h,异味刺激3 h,束缚2 h,摇晃鼠笼5 min,夹尾5 min,昼夜颠倒,强度为1 mA的电流刺激3 次、持续2 s,4 ℃冷水游泳5 min,45 ℃热水游泳5 min),每天随机选择2种刺激(避免连续重复的刺激源),建立CUMS模型[14]。动物模型复制期间,每周测量并记录体质量。模型复制结束后,立即进行行为学测试。

从建立CUMS模型的第3周开始,正常组、模型组、电针组小鼠给予0.5 mL生理盐水灌胃3周;VC组小鼠给予10 mg/kg VC注射液灌胃3周。电针组小鼠限制在固定装置内,采用0.15 mm×13 mm规格针灸针,先刺“百会”穴(位于顶骨正中),再刺两侧“神门”穴(位于前肢内侧腕部横纹尺骨边缘)与“三阴交”穴(位于后肢内踝尖直上约5 mm),针刺深度2～3 mm,通过脉冲针灸治疗仪对“神门”穴(正极)、“三阴交”穴(负极)进行电针刺激,频率为2 Hz,电流为0.5 mA,每日1次,每次持续20 min,持续干预3周。取穴参照中国针灸学会制定的《实验动物常用穴位名称与定位 第3部分:小鼠》[15]。正常组、模型组和VC组的小鼠仅被限制于同样装置,不予电针干预。

2.2.2 急性抑郁模型复制及干预措施 小鼠经1周适应后,按2 mg/kg剂量腹腔注射浓度为200 ng/mL的LPS,建立小鼠急性抑郁模型[13]。NAC组小鼠经脑定位(前囟后0.8 mm,硬脑膜下2.0 mm)后,注射3 μL NAC至D3侧脑室。CI小鼠在评估小鼠海马炎症因子水平之前按2 mg/kg经腹腔注射CI。NAC和CI的给药剂量参考文献[8]。

2.3 各组小鼠体质量比较 体质量是机体生长发育的一个重要指标,可以反映小鼠的生长情况。实验开始后,采用电子天平测量每只小鼠体质量,每周1次,连续7周监测各组小鼠体质量变化。

2.4 行为学测试

2.4.1 蔗糖水偏好实验 CUMS模型复制开始后,每周进行蔗糖水偏好实验1次。每只小鼠分别饮用40 mL的自来水和40 mL的1%蔗糖水各1瓶,待24 h后,测量每只小鼠消耗的糖水量及自来水量(每次测试时,随机摆放两个水瓶的位置),计算蔗糖偏好指数。蔗糖偏好指数=蔗糖摄入量/液体总摄入量×100%。

2.4.2 旷场实验 以5 min为观察时限,对每只小鼠的活动进行同步视频拍摄并记录相关参数。采用上海欣软信息科技SuperMaze动物行为学视频分析软件分析和比较各组小鼠的运动总路程。

2.4.3 强迫游泳实验(forced swim test,FST) 将小鼠放入水温为(22±3)℃的2 000 mL玻璃容器中,使其游泳6 min,前2 min为适应期,记录其后4 min小鼠放弃挣扎、静止不动的时间。采用上海欣软信息科技SuperMaze动物行为学视频分析软件分析和比较各组小鼠强迫游泳不动时间。

2.4.4 悬尾实验(tail suspension test,TST) 将小鼠放入测试房间中适应环境1 h,固定点取自小鼠距尾端2 cm处,使其保持倒挂状态,台面距头部约50 cm,用板隔开小鼠两侧视线。实验共需录制视频6 min,前2 min为适应期,记录其后4 min小鼠放弃挣扎、静止不动的时间。采用上海欣软信息科技SuperMaze动物行为学视频分析软件分析和比较各组小鼠悬尾不动时间。

2.5 ELISA法检测小鼠海马组织SOD活性,MDA、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-1β、5-HT水平以及血清CORT水平 行为学实验之后,经5%异氟烷麻醉并断头处理小鼠,随后用剪刀和弯镊剥离颅骨,取出大脑,冰上提取海马组织和血。按照试剂盒说明书,检测小鼠血清和海马组织SOD活性,MDA、TNF-α、IL-1β、5-HT水平以及血清CORT水平。

2.6 Western blot法检测小鼠海马组织calpain-1、超视交叉核生物钟振荡蛋白(suprachiasmatic nucleus circadian oscillatory protein,SCOP)、IL-1β蛋白表达水平 海马组织分别加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)匀浆裂解。裂解液提取组织总蛋白后,经上样、电泳、转膜等过程。在4 ℃条件下一抗[β-actin(1∶1 000),calpain-1(1∶1 000),SCOP(1∶500),IL-1β(1∶1 000)]孵育过夜。PBST洗膜3次,每次10 min。二抗室温下孵育2 h后,运用化学发光试剂显影成像。使用Image J软件分析图像,计算各条带吸光度值。

3 结果

3.1 各组小鼠行为学比较 CUMS模型复制后第2周,小鼠体质量开始显著下降(P<0.05),蔗糖水偏好指数下降(P<0.05)。与模型组比较,VC组和电针组小鼠体质量均显著增加(P<0.05),蔗糖水偏好指数均显著上升(P<0.05)。FST和TST中,与正常组比较,模型组小鼠不动时间均显著增加(P<0.05);与模型组比较,VC组和电针组小鼠不动时间均显著减少(P<0.05)。在旷场实验中,各组小鼠运动总路程比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注:A.正常组;B.模型组;C.VC组;D.电针组;与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.2 各组小鼠海马组织5-HT、血清CORT水平比较 与正常组比较,模型组小鼠海马组织5-HT水平显著降低(P<0.05),CORT水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,VC组和电针组小鼠海马组织5-HT水平显著升高(P<0.05),CORT水平显著降低(P<0.05)。见图2。

注:A.正常组;B.模型组;C.VC组;D.电针组;与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.3 各组小鼠海马组织SOD活性和MDA水平比较 与正常组比较,模型组小鼠海马组织SOD活性显著下降(P<0.05),MDA水平显著上升(P<0.05);与模型组比较,VC组和电针组小鼠海马组织SOD活性显著升高(P<0.05),MDA水平显著下降(P<0.05)。见图3。

注:A.正常组;B.模型组;C.VC组;D.电针组;与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.4 各组小鼠海马组织calpain-1、SCOP和IL-1β表达水平比较 与正常组比较,模型组小鼠海马组织calpain-1、IL-1β表达水平显著升高(P<0.05),SCOP表达水平显著下降(P<0.05);与模型组比较,VC组和电针组小鼠海马calpain-1、IL-1β表达水平显著下降(P<0.05),SCOP表达水平显著升高(P<0.05)。见图4。

注:A.正常组;B.模型组;C.VC组;D.电针组;与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.5 各组小鼠海马组织1L-1β、TNF-α水平比较 与正常组比较,模型组小鼠海马组织TNF-α、1L-1β水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,CI组和NAC组小鼠海马组织TNF-α、1L-1β水平显著下降(P<0.05)。见图5。

注:A.正常组;B.模型组;C.CI组;D.NAC组;与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

4 讨论

CUMS是一种可以诱导动物出现抑郁样行为和类似抑郁患者生理病理状态的方法[16]。本实验通过复制CUMS小鼠模型,探讨电针改善小鼠抑郁样行为的内在机制。结果显示,电针“百会-神门-三阴交”组穴可以改善CUMS小鼠的抑郁样行为,其作用机制可能是通过对小鼠海马氧化应激-calpain-炎症信号轴的调控实现的。

针灸作为一种替代疗法,具有不良反应小、疗效佳等优点,尤其在治疗神经退行性疾病方面有显著的临床疗效[17]。百会归属于督脉,位于头部,具有醒脑开窍、安神益智、益精填髓之功[18];三阴交归属于足太阴脾经,是足太阴脾经、足厥阴肝经、足少阴肾经之交会穴,具有健脾、疏肝、益肾、调和气血等作用[19];神门归属于手少阴心经,位于腕部,具有宁心定悸、化痰定志、调和阴阳、安神利眠等作用[20]。因此,笔者选用 “百会-神门-三阴交”组穴进行研究。行为学测试结果显示,各组小鼠的运动总路程无统计学意义(P>0.05),表明CUMS模型复制以及电针干预对小鼠的运动功能没有影响;而电针干预可以改善CUMS小鼠抑郁样行为,但不会影响小鼠的自主活动。5-HT假说认为,5-HT能神经传递的减少是导致抑郁发生的病理生理基础[21];下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的改变是抑郁症的特征之一,故通过检测抑郁相关的特征性生化指标——5-HT和CORT的水平,可以观察抑郁的发生及改善情况。本研究发现CUMS模型复制后,小鼠海马组织5-HT水平下降,而血清CORT水平升高,说明小鼠表现出抑郁特征,而电针能逆转二者的异常,进一步说明电针对抑郁有正向的干预作用。

当机体遭受有害刺激时,机体内活性氧产生过多,而致机体氧化程度与氧化物的清除能力严重失衡[22]。SOD水平的降低以及自由基产生剂MDA水平的升高,可以反映机体氧化应激的进展状态[23]。电针干预后,小鼠海马SOD活性显著提高,而MDA水平显著降低,说明电针干预可以有效降低CUMS小鼠海马组织的氧化应激水平。此外,前期亦有研究[22]显示,针刺“百会-三阴交”能够抑制氧化性损伤,说明“百会-三阴交”组穴参与了调控氧化应激反应,从而改善了小鼠抑郁样行为。本研究中,笔者使用具有较强抗氧化性的VC作为阳性对照药,VC也有抑制CUMS造成的氧化应激损伤的作用,同时也展现了较好的抗抑郁样作用,该结果与前期文献结果一致[24-25]。

氧化应激是诱导calpain异常激活和炎症反应的一个重要原因,因而calpain可以连接氧化应激和炎症[26]。因此,笔者检测了calpain-1及其底物SCOP的表达和炎症反应的关键递质——细胞因子IL-1β。本研究结果表明,电针可以抑制CUMS小鼠海马组织calpain-1的表达,促进其底物SCOP的表达。为进一步验证calpain作为电针发挥抗炎作用的核心靶点,笔者使用calpain抑制剂CI,探索其发挥抗炎作用的内在机制。研究结果显示,CI能抑制LPS诱导的海马组织炎症反应,表明了CI在抑郁发生过程中有调控炎症反应的作用。本次研究进一步评价了抗氧化剂NAC对LPS诱导的海马炎症反应的抑制作用,进而证明了电针可能通过调控氧化应激-calpain-炎症信号轴发挥抗抑郁的作用。

综上,电针“百会-神门-三阴交”组穴可以有效改善CUMS小鼠的抑郁样行为,其内在机制可能是通过调控氧化应激-calpain-炎症信号轴实现的。该研究为针灸治疗抑郁提供了重要的实验证据。然而,研究中依然存在一些不足之处,如电针如何调控氧化应激,其深层次的机制仍然需要探究。有研究[27]报道电针能启动核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1的抗氧化体系,然而电针是否通过该体系发挥抗抑郁的作用仍然需要进一步探索。