T淋巴细胞内质网应激在脓毒症中的作用

白广旭 王 郝 崔 娜

脓毒症(sepsis)是临床常见急危重症,病情危重、进展迅速,年死亡人数逾百万,90天再住院率高达30%～43%,是导致重症患者死亡的第二大原因[1]。全球疾病负担研究数据显示,2017年全世界共有4890万脓毒症患者,死亡病例中1100万与脓毒症相关[2]。sepsis3.0将sepsis本质定义为感染诱发宿主免疫失衡所导致的致死性器官功能损伤,宿主免疫失衡成为脓毒症患者发生致死性器官功能障碍的核心机制[3]。大量研究表明,持续淋巴细胞减少与宿主免疫失衡的发生密切相关,是影响脓毒症患者预后的独立危险因素[4,5]。因此,越来越多研究者将视线聚焦于脓毒症患者淋巴细胞减少的病理生理机制,希望通过改善淋巴细胞增殖分化障碍来提高脓毒症患者临床预后[6,7]。

淋巴细胞程序性死亡是导致脓毒症患者淋巴细胞减少的重要因素,细胞自噬和凋亡在这一过程中发挥重要作用[8,9]。内质网(endoplasmic reticulum, ER)是细胞内参与分泌作用的重要细胞器,通常被称为蛋白质折叠工厂,负责蛋白质的转位、折叠和翻译后修饰,使蛋白质进一步转运到高尔基体。此外,内质网还是钙离子储存、脂质合成和碳水化合物代谢的重要场所。研究表明,在脓毒症、创伤、缺血、病毒感染以及某些特殊药物引起的病理状态下,大量未折叠或错误折叠蛋白积累,改变内质网稳态,引起内质网应激(ER stress)[10,11]。内质网通过3种超特化的前哨内质膜包埋蛋白来感受应激,它们分别是肌醇需求蛋白1 (inositol-requiring protein 1,IRE1)、双链RNA依赖蛋白激酶(RNA-dependent protein kinase,PKR)样内质网激酶(double-stranded PKR-like ER kinase,PERK)、和转录激活因子6(activating transcription factor 6,ATF6)。当这些传感器识别到逐渐增强的内质网应激时,会引发内质网呈现精细且复杂的适应性反应,通过这些信号级联减少内质网中未折叠蛋白的积累,重建细胞内稳态,称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)[12]。而当UPR无法解决蛋白积累问题时,就会激活包括细胞凋亡和细胞自噬在内的细胞程序性死亡(图1)[13,14]。

图1 ER stress引起细胞凋亡的机制

目前,大量研究证实,内质网应激参与脓毒症、神经退行性疾病、癌症和糖尿病等多种疾病的发生、发展,在部分炎症性疾病和肿瘤的动物研究中,通过药物或基因治疗策略来抑制T淋巴细胞内质网应激已经成功阻断其病理进展,内质网应激和UPR信号通路的调控机制以及针对这一通路的策略越来越受到人们的关注,对T淋巴细胞内质网应激的研究有望揭示脓毒症免疫治疗新靶点[15～19]。

一、内质网应激及其信号通路

内质网是由小管和扁平囊泡构成的复杂网络,为了保证蛋白质折叠的准确性,内质网通过相关基因维持环境内平衡,保证网内蛋白负荷与其调控蛋白负荷的能力相匹配(表1)。蛋白质折叠是由与内质网结合的伴侣蛋白介导完成,包括蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)和Hsp70家族成员葡萄糖相关蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78),又称结合免疫球蛋白(binding protein,Bip)、钙联蛋白、钙网蛋白[20]。而内质网应激是指氧化还原调节紊乱、炎症超负荷、钙稳态失衡或蛋白质过表达等一系列病理状态所导致的蛋白质折叠机制受损。为了保护细胞免受这种压力,细胞通过协调和整合未折叠蛋白信号通路来恢复内环境平衡,维系正常的内质网功能,主要表现为:①内质网感受器通过抑制蛋白质翻译和限制准备在内质网中处理的mRNA池来减少蛋白质负荷;②诱导内质网伴侣蛋白正确折叠新生蛋白并使其转运到高尔基体;③激活内质网相关降解机制(endoplasmic reticulum associated degradation,ERAD)捕获未折叠蛋白。如果上述信号级联反应不足以恢复内质网应激,则细胞功能受损,凋亡就会启动。

表1 与脓毒症有关的内质网应激相关基因

因此,UPR是一把双刃剑,适度激活对细胞有保护作用,过久则威胁细胞,可能导致细胞功能障碍、死亡和疾病。UPR由上下游两个部分构成。上游是位于内质网膜上的一系列特殊的应激感受器,包括IRE1、PERK和ATF6;下游则是与之相对应的特异性转录因子,包括eIF2α(对应PERK),碎片化的ATF6(对应ATF6)以及剪辑后的XBP1(对应IRE1),直接激活或重新编程伴侣蛋白的基因表达使其能够适应应激或诱导凋亡。

研究发现,内质网应激主要通过3条信号通路引起细胞凋亡(图2)[21,22]。第1条通过IRE1、PERK、ATF6介导的转录性激活C/EBP同源蛋白基因(C/EBP homologous protein,CHOP)引起凋亡;第2条是由IRE1介导激活c-Jun N-端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路,之后再进一步激活TNF受体相关因子2 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,TRAF2)和凋亡信号调节激酶1 (apoptosis signal regulating kinase 1,ASK1)启动凋亡;第3条则直接通过细胞死亡程序相关的caspase-12来激活凋亡。Nagakawa等[23]研究发现,在阿尔茨海默病实验模型中,caspase-12缺陷小鼠对ER stress诱导的凋亡具有抵抗性,表明小鼠caspase-12是内质网应激的关键调节因子,可能是极具潜力治疗靶点。因此,在实验模型系统中研究UPR通路并监测内质网应激对研究脓毒症及其他临床相关疾病的致病机制具有重要意义。

图2 ER stress引起细胞凋亡的信号通路

内质网应激调控UPR也同样通过3条信号通路。第1条信号通路是 IRE1-XBP1轴。IRE1/XBP1轴被认为是UPR进化保守的核心通路,小到酵母菌,大到人类,其广泛存在于各类生物,对哺乳动物的发育过程至关重要[24]。IRE1是一种定位于内质网膜的Ⅰ型跨膜蛋白,参与UPR信号通路中的信息传递。其氨基末端区域存在于内质网腔内,是具有两种不同功能的结构域。被称为激酶域和RNA酶域。激酶域可以感知未折叠蛋白的蓄积,并跨过内质网转导信号。当内质网腔中有未折叠蛋白或错误折叠蛋白蓄积时,IRE1位于内质网腔的结构域被诱导发生二聚化,激活胞质的蛋白激酶域,进而发生自身磷酸化作用。而当胞质段蛋白激酶域激活后,会进一步激活特定位点羧基末端的RNA酶域活化,从而在XBP1-U特定的内含子和外显子区域进行切割,产生具有高度转录活性的XBP1-S。XBP1蛋白与参与UPR和ERAD的多个基因启动子结合,以恢复蛋白质稳态并提供细胞保护。

研究表明,在T淋巴细胞中选择性缺乏XBP1的卵巢癌小鼠表现出优异的抗肿瘤免疫能力,延缓了恶性进展并提高了总生存率。控制内质网应激或靶向调控IRE1-XBP1信号通路可能有助于恢复肿瘤宿主T淋巴细胞的代谢适应性和抗肿瘤能力,提示XBP1在免疫应答中发挥重要作用[25]。此外,除了核糖核酸内切酶,激活的IRE1还可作为激酶与TRAF2结合,进而招募ASK1并激活JNK和p38 MAPK的磷酸化。IRE1依赖的JNK激活是激活转录因子CHOP和NF-κB的重要信号机制,其改变基因表达,有助于细胞凋亡和炎性反应。IRE1还参与自噬激活。有研究指出,sXBP1占据了TF(转录因子)EB启动子的-743～-523位点,而TFEB是自噬和溶酶体生物发生的主要调节因子;在小鼠中,肝脏中XBP1的缺失抑制了TFEB的转录和自噬,而肝脏中XBP1-S的过表达增强了TFEB的转录和细胞自噬[26]。总之,IRE1/ XBP1轴是维持各种生理过程的关键,并在细胞死亡和适应应激方面发挥双重功能,其功能方向取决于细胞类型和应激刺激的程度。

ER stress调控UPR的第2条信号通路是PERK信号通路。PERK的内质网结构域与IRE1相似,同样作为Ⅰ型跨膜蛋白定位于内质网膜,感知未折叠的蛋白。然而其细胞质结构域并无RNA酶域而只具有激酶活性。简单来说,在没有内质网应激的情况下,GRP78与PERK的内质网结构域结合,抑制其激活。在ER Stress下,PERK与GRP78分离,通过二聚化和第51位丝氨酸磷酸化激活,进而使启动因子eIF2α失活,从而抑制一般蛋白向内质网的转译。这种抑制作用通过减少错误折叠或未折叠的蛋白质进一步流入内质网来降低内质网应激。

ER stress调控UPR的第3条信号通路是ATF6信号通路。ATF6是位于内质网的Ⅱ型内质网跨膜蛋白。其内质网结构域与IRE1和PERK相同,用以感知错误折叠蛋白,但在胞质部分ATF6有一个包含碱基亮氨酸拉链基序(bZIP)和转录激活的DNA结合结构域[27]。在正常情况下,ATF6被合成为非活性前体并与GRP78结合。在内质网应激下,ATF6从GRP78中分离出来,通过囊泡运输转移到高尔基体。在高尔基体中,它被一对加工蛋白酶所切割,分别称为位点1蛋白酶(S1P)和位点2蛋白酶(S2P)。这种蛋白水解导致其胞质域ATF6f (ATF6的一个片段)的释放,它是ATF6的一种活性形式。ATF6活性片段易位进入细胞核,强化ERAD和蛋白折叠相关的分子伴侣和多个基因,如GRP78、GRP94、钙网蛋白以及内质网应激应答元件(ERSE)的表达,通过促进错误/未折叠蛋白的水解来降低内质网应激[28]。

二、内质网应激是脓毒症相关细胞凋亡的重要机制

随着对内质网应激认识的不断加深,笔者发现,抑制内质网应激可稳定蛋白构象,促进突变蛋白的转运,提高内质网折叠能力,不仅是糖尿病、囊性纤维化、创伤出血和器官缺血性损伤等多种疾病的重要潜在发病机制,而且与脓毒症相关细胞凋亡密切相关[29,30]。Ferlito等[31]研究发现,凋亡因子CHOP的表达在脓毒症小鼠中显著增强,通过给予H2S抑制CHOP表达可提高脓毒症实验模型的存活率,表明内质网应激参与脓毒症发生。Zhang等[15]研究显示,内质网应激成分(GRP94、CHOP和caspase-12)在脓毒症大鼠心脏中上调,抑制内质网应激可保护大鼠心肌免受内质网应激诱导的凋亡。除此之外,内质网应激可导致脓毒症小鼠淋巴细胞凋亡异常,提示内质网应激介导的凋亡通路可能成为临床预防和治疗脓毒症相关淋巴细胞凋亡的新靶点[32]。这些研究大大增加了人们对内质网应激和脓毒症病理生理机制的认识,同时也提出了脓毒症相关免疫治疗可能的新靶点和新策略。

三、T淋巴细胞内质网应激是改善脓毒症免疫抑制的潜在靶点

关于T淋巴细胞内质网应激的研究,目前主要集中在肿瘤和自身免疫病领域。Thaxton等[18]研究发现,内质网应激可以通过调节胞质内钙离子来定义CD4+T淋巴细胞表型和功能,证明与内质网应激相关因子具备通过T淋巴细胞免疫进行肿瘤治疗的潜力。Cao等[33]研究指出,T淋巴细胞中CHOP的缺失改善CD8+T淋巴细胞自发抗肿瘤免疫特效,增强T淋巴细胞基础免疫治疗的疗效。他们发现,CD8+T淋巴细胞中的CHOP主要通过内质网应激相关激酶PERK和随后ATF4的诱导而升高,并直接抑制效应T淋巴细胞功能主要调控因子T-bet的表达,提出CHOP在肿瘤诱导CD8+T淋巴细胞功能障碍中发挥重要作用以及阻断CHOP或改善T淋巴细胞内质网应激提高抗肿瘤免疫治疗潜力的重要理念。

一项对照SLE和健康人群的研究发现,在药物诱导内质网应激作用下,SLE患者T淋巴细胞自噬水平较健康捐献者明显减低,凋亡水平显著增加,GRP78和内质网应激信号分子如PERK、p-eIF2α、IRE1和ATF6的表达明显减少,而凋亡因子CHOP的表达水平明显增高[34];抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-XL水平减低,而促凋亡因子Bax和caspase-6表达增加,从而推测内质网应激是导致T淋巴细胞异常自噬并参与SLE发病的重要机制。Wu等[35]通过脂多糖腹腔注射和盲肠结扎穿刺手术制造脓毒症体内和体外模型,利用动态相关蛋白1(dynamic related protein 1,drp1)选择性抑制剂mdivi-1处理后,分选出CD4+T淋巴细胞,发现其活性氧(reactive oxygen,ROS)产生显著减少,内质网应激和相关细胞凋亡受到抑制;应用tunicamycin药物诱导内质网应激后,mdivi-1对CD4+T淋巴细胞的保护作用被逆转,证明阻止内质网应激是mdivi-1在脓毒症中保护CD4+T淋巴细胞的潜在机制,mdivi-1作为一种新的治疗策略,可以靶向调节CD4+T淋巴细胞在脓毒症期间的凋亡。

此外,近年来发表在《Cells》上的一篇综述更进一步阐述了内质网应激在调节先天免疫细胞发育和功能分化中的重要作用[36]:①未成熟树突状细胞需要激活IRE1/XBP1才能在成熟树突状细胞中分化;②成熟的DCs在遇到损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)和病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)时,通过激活PERK/CHOP通路完成IL-23合成释放;③当巨噬细胞被Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)与DAMPs和PAMPs结合并释放激活信号后,IRE1作为TLRs的下游靶点,诱导XBP1剪接和炎性小体激活,从而促进巨噬细胞释放促炎性细胞因子IL-6和TNF-α。此外,在疾病背景下,脂质积累对内质网应激的过度激活会导致泡沫细胞的形成、细胞死亡和分解反应受损。其证据是在中性粒细胞中发现内质网应激的激活与发育过程中细胞死亡和组织损伤的增加有关。因此,可以预见的是,T淋巴细胞内质网应激作为改善脓毒症患者免疫抑制的靶点方面具备极大的潜力。

四、展 望

综上所述,内质网是一种对外部毒素和病原体侵袭极为敏感,可以感知细胞微环境任何变化的传感装置,它可以作为一个丰富的平台来理解环境信号和生物反应之间的相互作用。T淋巴细胞内质网应激及其相关UPR信号的研究在脓毒症免疫失衡方面具有极高的研究价值和研究潜力,将有助于更深入思考脓毒症免疫失衡的发生和发展,换一个角度去理解脓毒症T淋巴细胞免疫抑制的内在分子机制,有助于开拓新的治疗靶点,为脓毒症新型治疗手段提供理论基础,从实质上推进脓毒症免疫分子基础研究的临床应用转化进程。