牙齿萌出过程中骨改建的机制探究

秦 晗 蔡 军

牙齿萌出是在多种细胞、组织和细胞因子的参与下,牙齿器官和其周围牙槽骨组织相互作用、协同调节的复杂级联过程。在这个精密调节的过程中,无论是牙胚或是牙槽骨的任何一个环节发生改变都可导致牙齿的萌出异常[1]。关于牙齿萌出机制的研究至今未有定论[2]。

一、骨改建的动态平衡是牙齿萌出的关键

牙齿萌出时,随着牙胚的生长发育,在牙囊、牙槽骨和牙龈组织间产生一定的压力,促进局部组织破骨细胞分化,引起牙槽骨的吸收、萌出通道的形成[3]。同时牙槽窝底部骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞,形成新生骨质作为推动牙齿萌出的动力以及弥补牙冠方移动时其根方的骨质缺损[4]。因此骨改建的动态平衡是保证牙齿正常萌出的关键。

1.动物体内研究牙齿萌出骨改建过程:大量的动物学实验论述了牙槽骨吸收在牙齿萌出中的重要作用。有研究者对出生1.5～14.5天的小鼠下颌第一磨牙冠方牙槽骨中的破骨细胞进行研究,发现细胞的数量随着时间逐渐减少,第9.5天时,局部牙冠突破牙槽骨,此时破骨细胞作用明显减弱,第14.5天时无破骨作用,仅近远中牙槽骨处见少许破骨细胞,而后牙槽骨进一步被吸收,萌出通道形成[5]。Cahill对狗萌出中的前磨牙进行金属线阻挡实验,发现当金属线隔离牙胚冠方通道时,牙齿不能正常萌出,去除金属线后牙齿可继续萌出,这个经典的实验充分说明了萌出通道对牙齿的正常萌出至关重要。另有研究发现,给予小鼠抗破骨细胞分化因子的单抗或破骨细胞抑制剂——二磷酸盐后,小鼠牙槽骨内破骨细胞功能受限,萌出通道不能正常形成,导致牙齿不萌出或萌出滞后[6]。对构建成骨细胞特异性转录因子(runt-related transcription factor 2,Runx2)杂合突变小鼠模型研究发现,由于不能形成足够量的破骨细胞,导致颌骨吸收障碍及牙齿萌出延迟[7]。

2.临床研究牙齿萌出骨改建过程:临床研究同样证实了牙槽骨改建动态平衡在牙齿萌出中的重要作用。颅骨锁骨发育不良(cleidocranial dysplasia,CCD)是一种典型牙齿萌出障碍性疾病,多项研究表明,Runx2的杂合突变及基因插入、缺失等是造成CCD的重要原因。Runx2是一个具有编码Runt-DNA结构域家族中的核蛋白,对成骨细胞的分化成熟起到决定性的作用。在骨改建过程中,Runx2不但可以直接促进间充质干细胞分化为成骨细胞,而且还可以通过上调相关基因蛋白的表达进一步促进前成骨细胞分化成熟。当Runx2基因突变时易出现骨改建的异常,牙齿萌出障碍[8]。原发性萌出障碍(primary failure of eruption, PEE)发病机制尚未有全面认识,近年来从分子生物学基因角度研究发现,PEE的致病基因可能是编码甲状旁腺激素受体1(parathyroid hormone receptor 1,PTH1R)基因发生突变,打破成骨和破骨之间的动态平衡,临床表现为患者乳牙或恒牙不能正常萌出,局部牙槽骨塑形功能缺失[9,10]。

3.细胞学实验分析牙齿萌出骨改建过程:对体外培养的破骨细胞内加入巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配体诱导细胞的分化已作为一种成熟的培养方式,可以促进破骨细胞体积增生、核数量增多以及活性增强。这提示应用细胞因子进行骨改建动态平衡的调节或许是一种简便有效的方法。另有研究利用CCD患者的牙周膜细胞与破骨细胞的前体细胞共同培养后发现,破骨细胞分化减少,功能下降。说明CCD患者牙齿萌出障碍的一个主要原因便是破骨细胞形成和活化不足。另有研究对CCD患者的牙囊细胞体外培养并进行成骨诱导,发现Runx2基因突变严重干扰了牙囊细胞的成骨能力以及成骨细胞相关基因的表达,但是利用慢病毒过表达野生型Runx2可以逆转细胞的成骨分化异常[11,12]。这一研究提示,牙囊的成骨能力参与牙槽骨的重塑过程,在牙齿萌出骨动态平衡中发挥关键性作用,为CCD患者恒牙延迟出牙的机制提供有价值的解释和启示。

骨改建的动态平衡是牙齿萌出通道正常形成的重要基础,大量的信号通路参与了骨改建的动态平衡,与牙齿萌出密切相关的骨改建信号通路分述如下。

二、调节牙齿萌出通道形成的主要骨代谢通路

1.RANK/RANKL/OPG 系统与牙齿萌出:目前认为,RANK/RANKL/OPG系统是调节成骨、破骨细胞分化,参与牙齿萌出骨改建过程中最重要的信号通路[13]。破骨细胞核因子κB受体活化因子配体(receptoractivator of nuclear factor kappa-Bligand,RANKL)主要由骨髓间充质细胞、成骨细胞及一些肿瘤细胞表达,可以被许多因素激活。破骨细胞核因子κB受体活化因子(receptoractivator of nuclear factor kappa-B,RANK)位于破骨前体细胞膜表面,是RANKL刺激破骨细胞活化的直接靶受体。二者结合后促进破骨前体细胞活化,通过骨架重构使细胞形态发生改变,易于移动并黏附到骨吸收部位。骨保护素(osteoprotegerin,OPG)是RANKL的直接抑制剂,主要通过竞争性与成骨细胞/基质细胞的RANKL结合,阻断RANKL-RANK的结合,抑制破骨前体细胞的分化与成熟。

RANKL的阳性信号在与牙齿发育萌出相关的各部分组织中广泛表达,但是在不同时期其表达的部位和强度均不一致。动物实验研究表明,在小鼠牙齿萌出中期RANKL表达明显增强,OPG表达减弱,但是在萌出初期和后期牙槽骨内破骨细胞相对较少, RANKL表达强度较萌出中期减弱,与骨吸收的活跃程度保持一致[14]。通过对临床正常萌出和萌出障碍的牙齿进行研究,结果显示,牙槽骨组织中RANK和OC表达水平在二者间没有显著异常,但是局部的比值存在明显差异。RANK/RANKL比值主要作为骨吸收的指标,RANKL/OPG的比值主要作为骨改建平衡的指标。上述研究结果显示,在牙齿萌出障碍组RANK/RANKL下降的同时RANKL/OPG比值增加,提示此类患者的牙齿萌出障碍可能是因为骨骼重塑过程中牙槽骨吸收和形成的平衡失调进而影响出牙[15]。

2.Wnt信号通路与牙齿萌出:Wnt信号通路是调控机体内多种细胞形成、分化、迁徙和凋亡的主要通路,根据是否依赖β-catenin的转录活化,可分为典型(依赖性途径)和非典型(非依赖性途径)两类。成骨细胞系中典型Wnt信号的激活可增强OPG表达抑制破骨细胞分化,而非典型途径则通过诱导成骨细胞相关因子的表达促进成骨分化[16]。对类似人类牙齿发育的猪模型研究发现,直到乳牙开始萌出恒牙才从静止阶段过渡到初始阶段。乳牙萌出后释放下颌骨内累积的机械应力,进而诱导乳牙和恒牙间充质中Wnt信号下调和恒牙上皮中Wnt信号上调,触发恒牙发育的启动[17]。提示Wnt信号是器官更新的关键启动器,对牙齿再生机制研究提供一个新的视角。

牙齿萌出是上皮和间充质相互级联作用并伴有牙根形成的过程。在这个时空过程中,Wnt信号的正确表达对调节细胞增殖、分化、牙根形成及上皮-间充质相互作用至关重要[18]。多种Wnt配体及其下游转录因子从牙齿发育起始阶段便在上皮和间充质细胞中表达,当成骨和成牙细胞中β-连环蛋白的条件发生改变导致牙本质和牙骨质畸形。相反,若β-catenin过度表达则导致磨牙根变短、牙本质变薄和低矿化以及出牙失败[19]。通过体内、体外两个方面观察甲状旁腺激素相关肽(parathyroid hormone-related peptide,PTHrP)与牙囊细胞Wnt信号之间关系。体外研究表明,与PTHrP(1～34)共培养的牙囊细胞表达成骨细胞因子表达低于对照组,并且PTHrP(1～34)可能通过阻断Wnt/β-catenin通路抑制牙囊细胞的成骨分化。体内研究证实了体外实验的结果,即PTHrP(1～34)抑制牙囊成骨能力和牙槽骨的形成,加速牙齿的萌出[20]。

3.Notch信号通路与牙齿萌出:Notch信号通路是调节骨骼重塑和再生的又一重要信号系统,参与骨髓干细胞的增殖分化、成骨细胞形成和骨基质的钙化以及破骨细胞的融合和活化[21]。Notch共有4种配体,Notch1～4广泛存在于各类器官中并通过协调细胞的增殖、分化和活化,决定细胞命运的走向。在骨骼中Notch1既可抑制成骨细胞的分化与矿化,也可抑制破骨细胞的分化,Notch2可与NF-κB信号通路相互作用刺激破骨细胞的生成,Notch3则被认为促进破骨细胞分化同时抑制成骨的形成, Notch4低水平表达于骨组织中,因此对其在骨改建中的研究较少。进一步的研究提示,Notch信号对成骨和干细胞发挥刺激或抑制作用具有细胞环境的依赖性,与骨发育不同阶段细胞的形成和分化状况密切相关。那么在不断变化的牙齿发育与萌出过程中,Notch信号对牙槽骨的改建会发挥怎样的调节作用?

Notch信号作为一种高度保守的细胞间信号传递机制,通过副诱导作用调节干细胞的分化和增殖,参与牙齿整个发育萌出过程。Notch信号因子的表达和激活不仅在成牙和成骨细胞的分化、牙体硬组织的钙化、牙尖形态的构造及牙根的形成中起着关键性作用,而且对成熟牙齿相关损伤组织的再生也至关重要[22]。有研究发现,牙齿萌出时牙囊干细胞的Notch信号被激活,Notch1受体抑制碱性磷酸酶的活性和矿化结节的形成,对牙囊干细胞的成骨分化功能起到抑制作用[23]。在牙齿萌出后,Notch信号则可在牙髓的干细胞中被触发,诱导它们分化为成牙本质细胞,从而产生新的牙本质组织。同时Notch信号还可以与其他信号通路,如转化生长因子(transforming growth factor-β, TGF-β)、Wnt和音猬因子(sonic hedgehog,Shh)等相互作用共同调节牙齿的生长发育。

4.TGF-β信号通路参与牙齿萌出:TGF-β超家族成员是由成骨细胞和其他骨细胞产生的多效性生长因子,在促进骨形成和重塑中发挥重要作用[24]。TGF-β对成骨细胞具有激活或抑制双重作用,发挥何种作用取决于TGF-β不同的浓度和时间点以及不同的靶细胞和细胞分化阶段。但另有研究发现,TGF-β对成骨细胞自噬功能的影响不会随着浓度的增加而改变,这从一个新的角度为TGF-β生物效能研究和临床应用提供参考[25]。

TGF-β作为功能多样的生长因子,在牙齿发育萌出的不同部位和阶段都发挥协同调节作用。阻断牙囊细胞中TGF-β信号通路,会抑制该细胞向成骨细胞分化,导致牙齿萌出障碍和牙根形成不良[26]。通过对小鼠牙齿萌出期的牙周膜和牙槽骨中TGF-β进行研究,发现在牙槽嵴、牙尖和牙根间隔内有大量的骨形成,碱性磷酸酶活性增强,同时牙槽骨表面和牙周膜中TGF-β表达显著升高,并与Wnt信号通路相互作用,共同调控牙根分化。这些结果提示,可以通过对TGF-β的管理调节牙齿的萌出异常[27]。在这种理念的指导下,有研究者用博来霉素和外源性TGF-β1处理人和大鼠的牙囊细胞进行成骨诱导实验和信号转导分析。研究发现,博莱霉素和TGF-β1均可抑制牙囊细胞中成骨基因的表达,抑制了成骨能力,而且二者均通过TGF-β1信号通路发挥作用[28]。临床上TGF-β信号通路相关基因突变可引起牙齿和颜面部的发育异常,Loeys-Dietz综合征就是这种异常的典型性疾病。其主要临床表现为上颚高弓狭窄、牙釉质缺损、错颌、牙齿拥挤以及恒牙萌出延迟,具体的发病机制还有待于深入探究。

5.Shh信号通路与牙齿萌出:Shh信号通路在胚胎发育过程中有助于四肢的形成并在长骨纵向生长过程中调节软骨细胞的分化和骨组织的改建,同时该信号还可以调节骨骼修复和再生期间的干细胞分化。Shh主要在牙上皮中表达,参与牙齿萌出上皮向间充质转化并贯穿牙齿发育萌出的整个过程。通过对Shh信号在牙齿发育不同时期的功能进行研究,发现其可以参与调节牙齿各个部位的形成[29]。牙齿的形态发生涉及到上皮信号中心的活动,这些信号中心在其他分子中分泌Shh。Shh应答细胞需要完整的初级纤毛来进行信号转导,初级纤毛和鞭毛内运输(intraflagellar transport, IFT)蛋白在组织发育和体内平衡过程中控制着各个环节。在成牙细胞谱系中缺失IFT80的小鼠通过减少牙髓干细胞的增殖和分化以及破坏成牙细胞的极化,表现出磨牙根发育受损和前牙萌出障碍[30]。

发育中牙齿的上皮根鞘在牙根形成期间大量表达Shh,表明牙囊干细胞中Shh信号在牙根形成和牙齿萌出中发挥作用。牙囊干细胞是牙槽成骨细胞的前体细胞,骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein, BMP2)可诱导牙囊细胞的成骨分化,但是若经过BMP2诱导成骨分化后,牙囊干细胞中Shh信号转导途径则被抑制[31]。对特殊发育类型的牙齿——小鼠持续生长的门牙进行研究,发现来自感觉神经元的Shh在小鼠成年门牙稳态和硬组织修复中都起着关键作用,但不是干细胞增殖和维持所必需的[32]。临床上一些伴有牙齿发育异常的综合征可能与Shh信号通路异常有关,有数据分析表明,Shh通路在空间和时间上的活动中断是Ellis-van Creveld综合征患者发生牙齿异常的主要原因[33]。

综上所述,骨改建的动态平衡是牙齿正常萌出的关键,多种与骨改建密切相关的信号通路参与调节了这一过程,本文通过对与牙齿萌出骨改建的主要信号通路进行探讨,旨在拓展牙齿萌出过程中分子调控机制并为牙齿萌出障碍的诊治提供一定的参考。