电子烟用棉芯中高关注度化学成分的非靶向筛查和初步风险评估

李 丹，梁进欣，吴学峰，吴思亮，董 犇*，梁晶晶，李馨铎，任照芳，钟怀宁，陈 胜，郑建国

1. 广州海关技术中心 国家食品接触材料检测重点实验室（广东），广州市越秀区先烈中路100 号 510075

2. 深圳雾芯科技有限公司，深圳市宝安区新安街道龙井社区建安一路9 号 518104

3. 深圳神州经纬技术服务有限公司，深圳市宝安区新安街道龙井社区建安一路9 号 518104

在电子烟发展初期，使用玻璃纤维绳作为雾化导油材料［1-3］，该材料在静置过程中，不吸收烟油，很容易产生絮状物，消费者担心絮状物可能进入肺部而威胁人体健康［4-6］，因此，这种材料作为电子烟雾化芯的使用量逐渐减少。相反，棉芯导油具有还原度高，储油量大，导油性好，烟味饱满真实、烟雾浓密和口感更佳等优点。但棉芯作为直接接触高温烟油和烟雾的安全性尚未明确，且其分析技术的缺失导致难以开展系统性风险监测和安全评估工作。因此，亟需开展针对中国电子烟用棉芯材料中高关注度化学成分［7］检测技术的相关研究。电子烟雾化器中棉芯的化学成分比较复杂，当吸食电子烟而接触产生的化学成分并超量进入人体时，会威胁消费者的身体健康。国内外专门针对电子烟用棉芯的分析方法和安全评估的研究尚未见报道，一些研究主要是关于电子烟器件中不同器件和条件对气溶胶中缩水甘油［8］、丙烯醛［9］、苯［10］、无机元素［11］、烟碱［11］和酚类［12］等有毒有害化学成分释放量的影响。但利用上述研究结果对于来源于雾化芯的高关注度化学成分不能有效、快速地进行测试和评估。因此，亟需建立一种高效、快速、高通量的定性和定量分析方法，对棉芯的安全性进行评估以监测可能存在的风险。

全二维气相色谱串联四极杆飞行时间高分辨质谱（Two-dimensional gas chromatography-tandem quadrupole time-of-flight high-resolution mass spectrometry, GC×GC-QTOF-MS）具有峰容量大、灵敏度和分辨率高等优点，广泛应用在非靶向筛查领域［13-14］。超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱（Ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight high-resolution mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS）可提供母离子信息和丰富的子结构信息等，被视为未知物分析的有力手段［15］。电感耦合等离子质谱法（Inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）可有效避免光谱干扰，能同时检测多种元素，检测低限可达痕量级水平。为了对电子烟产品中的棉芯进行严格的质量管控，本研究中使用上述3种技术分别对电子烟用棉芯本身，以及在使用过程中产生的挥发性、半挥发性和不挥发性化学成分及元素进行非靶向筛查和分析，考察其是否释放潜在的风险化学成分而影响人体健康，旨在为对棉芯的安全性风险评估提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

电子烟用棉芯样品A（天然纤维）、样品B（人造纤维），由某电子烟品牌生产企业提供。

C6～C40正构烷烃混合物（≥99%）、庚醛（≥99%）、十三烷（≥99%）和水杨酸甲酯（≥98%）（色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司）；甲酸、甲醇（≥99%，色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司）；邻苯二甲酸丁苄酯-d4（标准品，≥98%，北京曼哈格生物科技有限公司）；邻苯二甲酸、己二酸二（2-乙基己基）酯（标准品，≥98%，上海麦克林生化科技股份有限公司）。

1290-6546超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱仪、8890-7250 全二维气相色谱-串联四极杆飞行时间质谱仪（美国Agilent公司）；SSM1800型固态调制器（雪景电子科技有限公司）；PAL RSI 120自动进样器（瑞士CTC Analytics AG 公司）；iCap RQ ICP-MS 电感耦合等离子体发射光谱-质谱仪（美国Thermo Fisher公司）；JS703C电子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）；Ethous-up微波消解仪（美国Milestone 公司）；Milli-Q50 超纯水仪（美国Merck Millipore 公司）；聚醚砜微孔滤膜（孔径0.45 μm，天津市津腾实验设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

挥发性化学成分：分别称取（0.16±0.01）g 样品A、（0.19±0.01）g 样品B 于顶空瓶中，直接或充氮气1 min 后密封；放入230 ℃烘箱中烘15 min，冷却至室温后取出，进行GC×GC-QTOF-MS分析。

半挥发性化学成分和不挥发性化学成分：分别称取（0.80±0.01）g 样品A、（0.95±0.01）g 样品B 于圆底烧瓶中，分别加入30 mL 95%乙醇、30 mL异辛烷，回流60 min。每种模拟液分别取6 mL于两个试管中，其中，一个氮吹至1 mL，过微孔滤膜，将滤液进行GC×GC-QTOF-MS 分析；另一个氮吹至干，随即用1 mL 甲醇复溶，过微孔滤膜，将滤液进行UPLC-QTOF-MS分析。

分别称取（0.80±0.01）g 样品A、（0.95±0.01）g样品B 于顶空瓶中，加入2 mL 丙二醇后，直接或充氮气1 min；密封后放入230 ℃烘箱中烘15 min，取出冷却至室温，分别用6 mL 95%乙醇、6 mL异辛烷于40 ℃下超声提取1 h。每种模拟液分别取6 mL于两个试管中，其中，一个氮吹至1 mL，过微孔滤膜，将滤液进行GC×GC-QTOF-MS 分析；另一个氮吹至干，随即用1 mL甲醇复溶，过微孔滤膜，将滤液进行UPLC-QTOF-MS分析。

元素：分别称取（0.16±0.01）g 样品A、（0.19±0.01）g 样品B 至聚四氟乙烯消解罐中，并各加入5～8 mL 硝酸, 封盖，预反应1 h，然后在60 ℃保持5 min，升温至120 ℃保持5 min，最后在160 ℃下保持40 min 后，冷却至室温；将消解液全部转移至50 mL 塑料容量瓶中，用纯水定容后摇匀，过微孔滤膜，将滤液进行ICP-MS分析。

以上各条件处理样品时，同时制作不加棉芯样品而其余操作步骤完全一样的全过程空白样品。

1.2.2 仪器条件

（1）GC×GC-QTOF-MS条件

色谱柱：HP-5MS弱极性毛细管柱（30.00 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Agilent公司）和中极性二维（2D）DB-17 毛细管柱（1.00 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Agilent公司）；固相微萃取针纤维为聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯/碳分子筛（PDMS/DVB/C-WR，10 mm，美国Agilent 公司）；萃取温度：80 ℃；萃取时间：30 min；解吸附时间：5 min；样品分析前，将SPME 萃取头在260 ℃老化10 min；色谱柱升温程序：40 ℃（5；分流模式：不分流；载气：氦气，流速1.2 mL/min；连接口温度：260 ℃；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；质量扫描范围：35～400 amu；扫描速率：100 spectra/s；溶剂延迟：5 min。

（2）UPLC-QTOF-MS条件

色谱柱：Poroshell EC-C18柱（150 mm×3.0 mm×2.7 μm，美国Agilent公司）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱条件：0～1.50 min，5% B；1.50～25.00 min，5%～98% B；25.00～32.00 min，98%B；32.00～32.10 min，98%～5% B；32.10～35.00 min，5% B；流速：0.35 mL/min；进样量：3 μL；质量扫描范围：100～1 000 amu；扫描速率：4 spectra/s；干燥气流速：8 L/min；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：12 L/min；毛细管电压：4 000，3 500 V；喷嘴电压：1 000 V；毛细管出口电压：150 V；锥孔电压：65 V；碰撞能量梯度：10，20，40 eV。

（3）ICP-MS条件

测量模式：动能歧视(Kinetic energy discrimination, KED)；半导体制冷温度：2.7 ℃；等离子体排气压力：> 50 Pa; 等离子体功率：1 550 W；雾化气流量: 1.0 L/min；系统真空度：< 5×10-5Pa；蠕动泵速率: 40 r/min；涡轮泵频率：> 800 Hz；冷却气流速：14 L/min；辅助气流速：0.8 L/min；进样吸取时间: 60 s；冲洗时间：45 s。

1.2.3 定性分析

采用Canvas 2.0［雪景电子科技（上海）有限公司］软件对GC×GC-QTOF-MS检出的挥发/半挥发性化合物进行定性，要求化合物质谱图与NIST17谱库的匹配度≥700，并且参考了化合物的保留指数RI。

利用MassHunter Qualification 10.0（美国Agilent 公司）软件对UPLC-QTOF-MS 检出的不挥发性化合物定性。通过自动提取MS/MS、匹配自建数据库分子式（使用标准品建立），筛选匹配得分≥80 的化学成分，经空白减法、化合物裂解规律、数据库二级质谱图、网络数据库（如MassBank, https://.ass.ank.eu/; PubChem, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）二次对比等方式鉴定化合物。

只有在3 个平行样中同时被定性的化合物才被认为是检出该化学成分；如果仅在一个样品中检出的化合物则不予考虑；如果化合物在2个平行样中被检出，则需通过检查二维色谱图以及相应保留时间的质谱图进一步确认。此外，通过比较叠加的二维色谱图进行验证，以提高化合物定性的准确性和可靠性。同时人工进行峰对齐以避免一维和二维的保留时间以及色谱图错位。

1.2.4 定量/半定量分析

针对GC×GC-QTOF-MS 检出的挥发性和半挥发性的脂肪族含氧化合物、非芳香族碳氢化合物和芳香族化合物，分别采用庚醛、十三烷和水杨酸甲酯进行定量和半定量。针对UPLC-QTOF-MS检出的不挥发性化合物，采用邻苯二甲酸丁苄酯-d4和己二酸二（2-乙基己基）酯作为标准品对正模式下检出的环状化合物和链状化合物进行半定量；对负模式下检出的所有化合物，采用邻苯二甲酸作为标准品进行半定量。所有半定量标准品均用甲醇配制成质量浓度分别为0.10、1.0、5.0、10和20 mg/L的标准溶液，绘制标准曲线。样品中各种被检出化学成分的质量分数按公式（1）计算。

式中：x为样品中检出化学成分的质量分数，mg/kg；c为定量或半定量浓度，mg/L；c0为空白样品质量浓度，mg/L；V1为样品提取体积，mL；V2为样品测试用体积，mL；V3为样品定容体积，mL；m为样品质量，g。

1.2.5 暴露量计算

根据前期进行的消费者消费习惯调研，约60%的电子烟消费者每天抽吸烟油的量约为0.7 mL。本研究中进行评估时采用3倍从严处理的方式，假设消费者每天抽吸烟油的量为2 mL，则样品中检出化学成分的暴露量按照公式（2）进行计算。

式中：Exp为暴露量，μg/d；x为样品中检出物的质量分数，mg/kg；m为样品质量，g；V0为每天抽吸烟油的量，mL/d；V为1颗烟弹中烟油的总量，mL。

消费者抽吸的烟油量按2 mL/d计；样品A（天然纤维）质量为0.165 g，1颗烟弹中对应的烟油的总量为2 mL；样品B（人造纤维）质量为0.199 g，1颗烟弹中对应的烟油的总量为3 mL。

2 结果与讨论

2.1 棉芯中需关注的主要化学成分分析

2.1.1 元素

在样品B中检出Ti，检出量为3 170 mg/kg；样品A中无检出。推测Ti可能来源于无纺布中添加TiO2所导致。添加TiO2可增强无纺布的力学性能［16］。

2.1.2 有机物

两种样品A 与B 中共检出72 种有机物，结果见表1和表2，其中，大部分是挥发性化学成分，半挥发和不挥发的化学成分较少。通过classfire［17］（https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/）将所有检出物分为了8类。如图1所示，脂类和类脂类化学成分（Lipids and lipid-like molecules）在样品A和B中检出最多，分别有17 和16 种，分别占检出成分总数的33.3%和29.6%。样品A中含氧有机物（Organic oxygen compound）和碳氢化合物（Hydrocarbon）类各有7种，所占比例均为13.7%。在样品B中含氧有机物和碳氢化合物分别有12 和10 种，分别占检出成分总数的22.2%与18.5%。对于有机硅化合物（Organosilicon compound），只在样品B中检出了硅酸乙酯，占1.9%。

表1 两种棉芯在不同条件下检出的挥发性化学成分①Tab.1 Volatile chemical components detected in two kinds of wicking cotton under different conditions

表2 两种棉芯在不同条件下检出半挥发性和不挥发性化学成分的质量分数Tab.2 Mass fractions of semi-volatile and non-volatile chemical components in two kinds of wicking cotton at different conditions（mg·kg－1）

对两种样品检出化学成分的质量数进行对比，结果见图2。可知，总体上两种样品以质量数在200 Da左右的化学成分为主，样品A的化学成分最高质量数（340.334 1 Da）大于样品B（298.287 1 Da），同时，两样品检出质量数的中位数相当（A: 186.198 4 Da; B: 179.025 6 Da）。这是因为检出的大部分化学成分以易挥发性成分为主；并且对比看来，有氮气保护前处理检出的挥发性化学成分更多，其中大部分为烷烃、烯烃和醛醇类等化学成分，推测可能是在加热情况下被氧化成了其他化学成分。

图2 两种样品检出化学成分分子质量对比小提琴图Fig.2 Violin plots of molecular mass of detected chemical components in two samples

两种样品检出化学成分的质量分数分布情况见图3a，除样品B 中糠醛（7.85 mg/kg）和糠醇（11.59 mg/kg）外，两种样品中检出化学成分的质量分数均在3 mg/kg以下，绝大部分检出化学成分的质量分数较为接近。使用Toxtree3.1 对检出化学成分进行基于毒理学关注阈值（Threshold of toxicological concern，TTC）法则的Cramer 分级［18］，对检出化学成分的风险性进行初步研究，结果见表1，其分布情况见图3b，共有18种属于Class Ⅲ的化学成分，50种属于Class Ⅰ的化学成分，以及4种属于Class Ⅱ的化学成分。其中，检出浓度最高的糠醛和糠醇均属于Class Ⅲ的化学成分，需要引起安全关注。同时，检出Class Ⅲ化学成分说明样品存在一定风险，需要进一步进行评估。

图3 两种样品检出化学成分的质量分数对比蜜蜂群图［19］（a）和检出化学成分基于TTC分类情况柱状图（b）Fig.3 Bee group plots of concentration of chemical components in two samples（a）and bar graph of detected chemical components based on TTC category（b）

2.2 初步风险评估

对检出化学成分进行暴露量计算的结果见表1和表2，其中，有9种化学成分的暴露量高于SCT值，包括糠醇、糠醛、二乙醇胺和Ti等。利用产品质量研究学会（The Product Quality Research Institute，PQRI）提出的检出化学成分的暴露量进行的浸出物安全性分析，其分析流程如图4所示。结果表明，除糠醇和糠醛外，其他7种化学成分均未列入流程中标准法规的致癌化学成分清单，进一步参考文献［21］核查其结构，排除其中属于警示结构的化学成分。此外，计算出Ti 的暴露量为421 μ g/d，超过QT 值（Qualification threshold，界定阈值）。因此，重点评估暴露量高于QT值的化学成分（Ti）以及暴露量高于SCT值的致畸、致癌和致突变化学成分（糠醇、二乙醇胺）。

图4 检出化学成分的风险评估分析流程Fig.4 Flow chart of risk assessment of detected chemical components

根据美国 EPA（Environmental Protection Agency，美国环境保护署）发布的《人类健康评价手册，补充指南：标准默认暴露因子更新版》（2014）［22］以及GB/T 16886.17—2005 中对可沥滤物允许限量的规定［23］，本风险评估中假设一个70 kg体质量的成人每天空气的摄入量为20 m3。采用来自欧洲化学品管理局（European Chemicals Agency，ECHA）某种化学成分的一般人群或职业人群经吸入途径的健康指导值，该值通过危害评估推导的无作用剂量（Derived no effect level，DNEL）值乘以空气摄入量计算得到；对于无吸入暴露途径毒理学数据的化学成分采用经口途径的危害评估DNEL 值进行评估。将化学成分的暴露量与健康指导值进行比较，评估其对人体健康危害的可能性，若低于健康指导值则表明其对人体健康产生危害的可能性比较低。同时通过PubChem［24］（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）提取化学成分的其他毒理学数据库信息，包括联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会（Joint Expert Committee for Food Additves，JECFA），美国国家职业安全卫生研究所（National Institute for Occupational Safety and Health，NIOSH）的数据库信息等。综合考虑各种限量值，取最低限量值进行健康指导值的推算。由表3可知，在本研究的背景下，两种棉芯中需评估的4种高关注化学成分的暴露量均远低于健康指导值，对人体健康产生危害的可能性比较低。

表3 重点化学成分评估暴露量Tab.3 Exposure assessment of key chemical components

3 结论

①在两款样品中共检出8 个类别72 种化学成分，其中，大部分为挥发性化学成分，检出化学成分的质量分数大多在3 mg/kg 以下。②基于TTC 法（Threshold of toxicological concern，毒理学关注阈值）筛选出了18 种属于Cramer Ⅲ的化学成分，通过PQRI（The Product Quality Research Institute，产品质量研究学会）提出的浸出物SCT 值（Safety concern threshold，安全关注阈值）和QT 值（Qualification threshold，界定阈值）进一步筛选出暴露量较高、可能具有潜在风险的9 种有机物和金属元素Ti。③对暴露量最高的糠醇、糠醛、二乙醇胺和Ti 4种化学成分进行风险评估，结果表明其暴露值均远低于健康指导值。④以上研究结果表明，基于丙二醇研究体系，本研究中所使用的两种电子烟用棉芯所检出化学成分的暴露量均远低于健康指导值，对人体健康产生危害的可能性较低。