广西壮族人群ADIPOQ 基因rs2241766T／G 多态性与T2DM 易感性的相关性分析*

刘义，黄丽红，李想，王凤，王禹，乔永超（桂林医学院附属医院.检验科，.老年病科，广西桂林 541004）

2 型糖尿病（T2DM）是一种多基因遗传的进行性代谢疾病，其发生及演变与环境和遗传因素密切相关［1］。目前，临床上已对T2DM 的遗传易感性进行了大量研究，其中，脂联素基因（ADIPOQ）不同位点单核苷酸多态性（SNP）与T2DM 及其代谢参数间的关系在不同人群中被广泛报道［2-4］，然而，上述文献结果存在明显的不一致性。

一项荟萃分析结果表明，ADIPOQ基因rs2241766 SNP 与欧洲和东亚人群T2DM 不相关，并且对南亚和西亚人群的T2DM 影响结果呈现相反性［5］，其TG、TT 和TT+TG 基因型增加了西亚人群的T2DM 风险（P分别为0.02，0.01，0.01；OR分别为2.22，2.29，2.28；95%CI：1.14～1.32，1.21～4.34，1.21～4.28），但却降低了南亚人群的T2DM 风险（P分别为0.009，0.005，0.004；OR分别为0.54，0.53，0.53；95%CI：0.34～0.86，0.34～0.83，0.34～0.82）。这使得rs2241766 SNP 对T2DM 易感性的影响存在争议，上述SNP 的分布差异可能与人群、种族和地区相关，分布不同对T2DM 易感性的影响也不同。本研究旨在探讨广西壮族人群rs2241766 SNP 与T2DM 易感性及其多种代谢指标之间的潜在相关性，以期为T2DM 的早期预防、诊断、治疗及群体遗传学研究等提供实验依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象 招募2021 年9 月至2022 年1 月于桂林医学院附属医院内分泌科就诊的212 例T2DM 患者作为T2DM 组，其中男117 例，女95 例，年龄39.0～56.8 岁，中位年龄49.0 岁。纳入标准：T2DM 患者均遵循2020 年美国糖尿病协会的诊断标准［6］；均无相关药物治疗史（如二甲双胍、磺酰脲类、吡格列酮及胰岛素等用药）；均未合并重大并发症（如肾病、脑卒中、视网膜病变等）；均无糖尿病家族史。排除标准：排除T2DM 外的其他类型糖尿病（如1 型糖尿病和妊娠性糖尿病等）；均排除肝、肾、肺、心脑血管、自身免疫、重度感染、恶性肿瘤等重大疾病；排除具有重大外伤及近期手术史的患者。纳入同期在桂林医学院附属医院体检中心体检的289 例健康志愿者作为健康人对照组，其中男116例，女173 例，年龄35.0～48.0 岁，中位年龄42.0岁。各研究对象均属于独立的广西壮族个体，个体间均无亲缘关系。本研究方案获得桂林医学院附属医院医学伦理委员会审核批准（批准文号：QTLL202123），各研究对象均知情同意。

1.2 主要仪器与试剂 QT-1 漩涡混合器（上海琪特分析仪器公司），TD5A-WS 台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器公司），DK-8D 型电热恒温水槽（上海精宏实验设备公司），FR-110 紫外分析装置、FR-250 电泳仪（上海复日科技公司），多用途水平电泳槽（北京百晶生物科技公司），2720 Thermal Cycler 扩增仪、3130xl genetic analyze 分析仪（美国ABI 公司），Cabas8000 全自动生化免疫分析仪（上海罗氏诊断产品公司），Autolumo A2000 Plus 全自动化学发光测定仪（郑州安图实验仪器公司）。DNA 全血提取试剂盒（北京天根生化科技公司），SNPscanTM分型试剂盒、Tag DNA 连接酶（50 U／μL）、Tag DNA 连接缓冲液购自上海天昊生物科技公司，10×PCR 缓冲液、dNTP mix（2.5 mmol／L）、TaKaRa HotStart Taq DNA 耐热聚合酶（5 U／μL）购自日本TaKaRa 公司，Hi-Di 甲酰胺、GeneScanTM-600 染料购自美国ABI 公司，MgCl2（25 mmol／L）购自上海生工公司，葡萄糖测定试剂盒（葡萄糖氧化酶法）、尿素／尿素氮检测试剂盒（比色法）、肌酐检测试剂盒（苦味酸法）、三酰甘油检测试剂盒（比色法）、胆固醇检测试剂盒（酶比色法）、高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒（酶比色法）、低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒（直接法）及C 反应蛋白检测试剂盒（免疫比浊法）均购自上海罗氏诊断产品公司，促肾上腺皮质激素检测试剂盒、血管紧张素2 检测试剂盒、醛固酮检测试剂盒、肾素检测试剂盒、人生长激素检测试剂盒、胰岛素样生长因子1 检测试剂盒、人皮质醇检测试剂盒（均为磁微粒化学发光法）购自郑州安图生物工程公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集及临床生化指标测定 采集各研究对象体检或就诊时的空腹静脉血3～5 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，3 000 r／min 离心5 min，分离血浆和白膜层血液，置于2.5 mL EP 管中。严格按照试剂盒及仪器说明书操作检测血浆标本的各项临床生化指标，包括：空腹血糖（FPG）、尿素（Urea）、肌酐（Cr）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、C 反应蛋白（CRP）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、血管紧张素2（AⅡ）、醛固酮（ALD）、肾素（REN）、生长激素（GH）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）及皮质醇（Cor）。各指标的参考区间：FPG：3.9～6.1 mmol／L；Urea：2.14～7.14 mmol／L；Cr：男性62～106 μmol／L，女 性44～80 μmol／L；TG：＜2.26 mmol／L；TC：＜5.2 mmol／L；HDL-C：1.16～1.55 mmol／L；LDL-C：＜3.37 mmol／L；CRP：＜5 mg／L；ACTH：7.2～63.4 pg／mL；A Ⅱ：25～129 pg／mL（卧位）；ALD：40～310 pg／mL（站位）；REN：4～38 pg／mL（站位）；GH：男性＜0.02 ng／mL，女性0.024～5.419 ng／mL；Cor：4.26～24.85 pg／dL。

1.3.2 DNA 样本制备及浓度、纯度鉴定 取200 μL白膜层血液样本，按照人类基因组DNA 全血提取试剂盒说明书进行基因组DNA 提取。取1 μL DNA 样本通过紫外分光光度仪检测其吸光度（A260nm／A280nm）值，选取比值为1.7～2.0，浓度30～50 ng／μL，总量大于600 ng 的DNA 样本置于-80 ℃储存。

1.3.3 引物设计与合成 利用NCBI 在线数据库查询ADIPOQ基因rs2241766 位点的碱基序列，引物片段大小305 bp。采用Primer Premier 3.0 软件设计引物，并委托上海天昊生物科技公司进行引物合成。上游引物序列：5＇-TGAGTCGTGGTTTCCTGG TCAGGA-3＇，长度24 bp；下游引物序列：5＇-TTTGA GTCGTGGTTTCCTGGTCAGGC-3＇，长度26 bp。退火温度58～62 ℃，产物片段大小80～150 bp。

1.3.4 PCR 扩增及分型检测 样本裂解总体积为10 μL，包括：30～50 ng／μL DNA 样本4 μL，2.5 μL 4×DNA 连接缓冲液，3.5 μL ddH2O。样本裂解参数：98 ℃裂解5 min 后立即冰置。连接反应总体积为20 μL，包括：10 μL 裂解DNA 样本，2 μL 10×DNA 连接缓冲液，50 U／μL DNA 连接酶0.5 μL，1 μL连接探针混合物，6.5 μL ddH2O。连接反应参数：94 ℃1 min，58 ℃4 h，循环4 次；94 ℃2 min，72 ℃保存连接产物。多重荧光PCR 反应总体积为20 μL，包括：10 μL 2×PCR 混合物，1 μL 多重引物混合物Ⅰ／Ⅱ，1 μL 连接产物，8 μL ddH2O。多重荧光PCR 反应参数：95 ℃2 min；94 ℃20 s，62 ℃40 s（每个循环-0.5 ℃），72 ℃1.5 min，循环9 次；94 ℃20 s，57 ℃40 s，72 ℃1.5 min，循环25 次；68 ℃1 h，4 ℃保存产物。取1 μL 稀释10 倍的PCR 产物、0.5 μL Liz600 分子量内标与8.5 μL Hi-Di 混匀，95 ℃变性5 min 后用ABI 3730XL 测序仪进行荧光毛细管电泳分离，最终通过Gene-Mapper 4.1软件根据产物应有的位置是否出现检测峰判断是否有对应的等位基因，从而确定分型结果，各基因型包括：GG（单峰）、TG（双峰）和TT（单峰）。

1.4 统计学分析 采用SPSS 27.0 软件进行统计学分析。统计数据均以样本量100 为界限进行Kolmogorov-Smirnov 或Shapiro-Wilk 正态性检验，符合正态分布的计量资料均以表示，两组间比较采用独立样本t检验，两组以上比较采用One way ANOVA 检验；非正态分布的计量资料均以中位数（四分位数）［M（P25，P75）］表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验，两组以上比较采用Kruskal-WallisH检验。组间计数资料比较及Hardy-Weinberg 遗传平衡定律采用χ2检验；采用二元Logistic回归进行基因多态性遗传风险分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 广西壮族T2DM 患者与健康人群rs2241766T／G 多态性的比较ADIPOQ基因rs2241766T／G 位点的基因型和等位基因频率分布如下：T2DM 患者：GG（5.7%）、TG（44.3%）、TT（50.0%），G（27.8%）和 T（72.2%）；健康对照人群：GG（11.8%）、TG（37.7%）、TT（50.5%），G（30.6%）和T（69.4%）。基因型频率符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（T2DM 组：χ2＝2.57，P＝0.28；健康人对照组：χ2＝4.62，P＝0.1），表明所选研究对象的ADIPOQrs2241766T／G 基因型分布具有良好的群体代表性。T2DM 组与健康人对照组间基因型频率差异具有统计学意义（χ2＝6.294，P＝0.043）；两组间等位基因频率相近，差异无统计学意义（χ2＝0.918，P＝0.338）。见表1。

表1 广西壮族T2DM 患者及健康人群ADIPOQ 基因rs2241766 SNP 的频率分布及风险评估

2.2 广西壮族 T2DM 患者ADIPOQ基因rs2241766T／G 多态性的风险评估 Logistic 回归结果显示，相比于GG 基因型，TG（OR＝2.443，95%CI：1.197～4.988，P＝0.014）、TT（OR＝2.057，95%CI：1.017～4.159，P＝0.045）及TG+TT（OR＝2.222，95%CI：1.122～4.402，P＝0.022）基因型与T2DM 风险增加显著相关。在调整性别和年龄共同混杂因素后，此相关性仍持续存在，rs2241766T／G 的TG、TT 及TG+TT 基因型患T2DM 风险分别是GG 基因型的2.863 倍（OR＝2.863，95%CI：1.352～6.060，P＝0.006）、2.291 倍（OR＝2.291，95%CI：1.094～4.800，P＝0.028）和2.532 倍（OR＝2.532，95%CI：1.235～5.192，P＝0.011）。见表1。

2.3 广西壮族T2DM 患者与健康对照人群的一般临床资料比较 如表2 分析结果显示，相比于健康人对照组，T2DM 组的男性频率、中位年龄及血浆FPD、Urea、TG、CRP、AⅡ、REN、GH、Cor 水平升高，而HDL-C、ACTH、ALD、IGF-1 水平下降，差异具有统计学意义（P均＜0.05）；血浆Cr、TC、LDL-C 水平在T2DM 组中虽呈升高趋势，但两组间差异无统计学意义（P均＞0.05）。

表2 广西壮族T2DM 患者和健康对照人群的一般临床资料比较

2.4 广西壮族人群同种rs2241766T／G 基因型的代谢指标比较 相比于健康人对照组GG 基因型，T2DM 组GG 基因型的FPG、AⅡ、REN、GH、Cor 水平升高，ACTH、ALD、IGF-1 水平下降，差异具有统计学意义（P均＜0.05）。FPG、Urea、TG、TC、CRP、AⅡ、REN、GH、Cor 水平在两组TG 型间的差异仍具统计学意义（P均＜0.05），且在T2DM 组呈现高水平状态；而HDL-C、ACTH、ALD、IGF-1 则呈低水平趋势（P均＜0.05）。T2DM 组TT 型的FPG、Urea、TG、CRP、AⅡ、REN、GH、Cor 水平明显高于健康人对照组，但其HDL-C、ACTH、ALD、IGF-1 水平则相反（P均＜0.05）。见表3～5。

表3 T2DM 患者与健康对照人群GG 基因型的临床代谢指标比较

表4 T2DM 患者与健康对照人群TG 基因型的临床代谢指标比较

表5 T2DM 患者与健康对照人群TT 基因型的临床代谢指标比较

2.5ADIPOQrs2241766T／G 多态性对T2DM 代谢指标的影响 T2DM 患者的FPG、Urea、TG、TC、HDL-C、LDL-C、CRP、ACTH、AⅡ、ALD、REN、GH、IGF-1、Cor 水平均不受rs2241766T／G SNP 显著影响，各基因型间差异无统计学意义（P均＞0.05），但三组不同基因型患者的Cr 水平差异有统计学意义（P＝0.049），rs2241766T／G SNP 可影响广西壮族T2DM 患者的Cr 代谢水平。见表6。

表6 不同rs2241766T／G 基因型T2DM 患者的临床代谢指标比较

3 讨论

T2DM 是一种常见的慢性进行性代谢疾病，常导致机体各种代谢参数出现异常［7-9］。本研究发现T2DM 患者的FPD、Urea、TG、CRP、AⅡ、REN、GH、Cor 水平高于健康对照人群；而HDL-C、ACTH、ALD、IGF-1 水平低于健康人对照人群，符合T2DM的代谢特征［10］。

ADIPOQ作为糖尿病肾病候选基因［11］，被证实与代谢综合征及T2DM 易感性相关［4，12-14］。其中，rs2241766 SNP 在不同人群中被广泛报道。本研究结果发现，TG、TT 基因型及TG+TT 基因型均与T2DM 易感性增加显著相关。在调整性别和年龄共同风险因素后，此相关性仍显著；TG、TT、TG+TT基因型患T2DM 的风险分别是GG 基因型的2.863、2.291 和2.532 倍，表 明rs2241766G／T SNP 为T2DM 风险因素，且TG 和TT 基因型可能是T2DM易感基因型，而GG 基因型可能对其有保护作用。此相关性与以往不同人群中的研究结果呈现一致性［3，15-17］，但仍与部分报道结果相悖，例如Han等［18］研究表明此多态性与T2DM 不相关。本研究还发现，无论是T 等位基因还是G 等位基因均与广西壮族人群T2DM 风险不相关，不构成其易感因素。但近期针对中国台湾人群的研究表明，携带G等位基因的中国台湾个体发生T2DM 风险比携带T等位基因人群高0.82 倍［2］；Dong 等［5］的一项荟萃分析结果表明，rs2241766 T 等位基因增加了西亚人群T2DM 风险，而相同等位基因却降低了南亚人群的T2DM 风险。综上所述，地区差异、人群不同及群体遗传多样性可能是造成上述结果差异的潜在原因。本研究针对的是广西壮族人群，虽与中国台湾人群同属中国个体，但极大可能存在种族遗传差异性，导致所得结果相矛盾。T2DM 的发生本是一个复杂的过程，受不同基因、不同SNP 及环境因素等共同影响，本研究中调整因素较少，其他外源混杂因素可能对研究结果有潜在影响。以往报道rs2241766G／T SNP 与糖尿病多种代谢参数相关［19-21］，但本研究仅发现Cr 水平受此多态性影响，并且影响结果位于统计学临界值（P＝0.049），分析原因可能本研究样本量有限和样本选择偏倚降低了研究结果的权威性，后续将进一步扩大样本量，排除更多混杂因素进行更精确分析。

本研究评估ADIPOQrs2241766G／T SNP 与广西壮族T2DM 易感性间的相关性，丰富了ADIPOQSNPs 在人类群体遗传学方面的研究。但本研究仍存在局限之处，包括研究对象来源单一、未排除基因—环境相互作用的影响、样本量不足及排除混杂因素少等。后续的ADIPOQSNP 研究将进一步加大样本量及扩宽研究对象纳入范围。综上所述，ADIPOQrs2241766G／T 多态性与广西壮族T2DM易感性增加显著相关，可能是预测T2DM 风险的潜在遗传标志物；对携带TG 和TT 基因型的个体进行早期干预可能是预防和延缓T2DM 发生和进展的有效手段。