USP26 负性调控RLR 信号通路对肠道病毒71 型复制的影响*

许超，盛成兰，蒋邦栋，张春秋，史伟峰（.上海市第十人民医院崇明分院检验科，上海 050；.苏州大学附属第三医院检验科，江苏常州 3003）

肠道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）是引起儿童重症手足口病的重要病毒之一，其临床表现除了典型的在手、足、口、臀等部位出现疱疹以外，还会继发严重的心肌炎、脑膜炎和神经源性肺水肿等并发症，甚至导致死亡［1］。目前，对于重症手足口病的治疗主要是对症治疗，尚没有特效药物，重症病例的致死率居高不下。泛素特异性蛋白酶26（ubiquitin-specific protease 26，USP26）是去泛素化酶家族中的重要一员，其诱导底物蛋白活化或失活，达到调节信号通路的作用，主要功能是影响肿瘤的生成、发展和男性不育［2-5］，在抗病毒方面国内目前尚无报道。本研究旨在探讨在EV71 的感染细胞过程中USP26 负性调控RLR 信号通路，为人类认识EV71 逃逸宿主免疫应答提供一条新思路，以期为相关的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 抗体、病毒和细胞来源 兔抗人USP26 和兔抗EV71／VP1 抗体（美国Gene Tex 公司），兔抗人MDA5、兔抗人GAPDH 和兔抗人IRF3 抗体（美国Proteintech 公司），兔抗人磷酸化IRF3 抗体（美国Affinity 公司），辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔lgG 抗体（美国Proteintech 公司）。EV71 病毒株GDV083（ATCCVR784，基因编号：U22521）购自中国科学院武汉病毒所，人横纹肌肉瘤（RD）细胞购自中国科学院细胞资源中心。

1.2 主要试剂与仪器 DMEM 培养基和10%胎牛血清（美国Gibco 公司），2.5 g／L 胰蛋白酶（美国Hyclone 公司），细胞培养瓶、培养板、离心管、冻存管（美国Corning 公司），Trizol 试剂、Lipofectamine 3000 转染试剂（美国Invitrogen 公司），5×SDS 蛋白质上样缓冲液、蛋白质提取试剂盒、配蛋白胶试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒（上海碧云天公司），5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液、10×电转液（北京索莱宝公司），聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）、ECL 化学发光显影液（美国Millipore 公司），10×PBS（美国Thermo公司），RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR 试剂盒（日本TaKaRa 公司）。CLINX化学发光成像系统（上海勤翔科技公司），SMA1000超微量紫外分光光度计（北京普莱恒通科技公司），7500 实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司），低温高速台式离心机（美国Bierlofuge 公司），凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad 公司）。USP26 siRNA 和阴性对照siRNA 由苏州金维智公司设计合成，序列见表1；USP26（USP26基因ID：83844）、EV71／VP1和GAPDH引物根据基因序列（EV71／VP1基因ID：KU645338.1），采用Primer Premier 5.0 软件设计，并由苏州金维智公司合成。见表2。

表2 USP26 和EV71／VP1 引物序列

1.3 EV71 病毒感染RD 细胞 取生长状态良好的RD 细胞，用10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培养基常规培养，待细胞融合度达90%时，弃去培养基，PBS 洗涤2 次，用2.5 g／L 胰蛋白酶消化细胞，接种于6 孔细胞培养板（每孔4×105个），继续培养24 h。加入感染复数（multiplicity of infection，MOI）＝1 的EV71 病毒，室温温育1 h 后，更换新的DMEM 培养基继续培养，在0、2、4、8、12 和24 h 时经2.5 g／L 胰蛋白酶消化，1 000 r／min 离心5 min，收集细胞，提取RNA 或蛋白质用于目的基因或蛋白质检测。

1.4 实时荧光定量PCR（RT-PCR）取1.3 中各组细胞，采用Trizol 法裂解细胞并提取总RNA，SMA1000 超微量紫外分光光度计检测提取RNA 浓度和纯度，取浓度为300～500 ng／μL，吸光度（A260nm／A280nm）值为1.80～2.0 的RNA 样本用于后续试验。按照逆转录试剂说明书将RNA 逆转录为cDNA，cDNA 样本置于-20℃保存。PCR 总体系为20 μL，包括SYBR Green Master mix 10 μL，ROX 校正染料Ⅱ0.4 μL，10 μmol／L 上、下引物（根据表2，针对目的基因加入对应引物）各0.4 μL，cDNA 2 μL，RNA Free ddH2O 6.8 μL。PCR 循环参数：95 ℃10 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃15 s，共40个循环。在60 ℃时用实时荧光定量PCR 仪配套v2.0.6软件收集荧光信号。采用2-ΔΔCt法计算VP1mRNA 相对表达水平，ΔΔCt ＝（Ct目的基因-Ct内参基因）实验组-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照组，内参基因为GAPDH。每个样本设置3 个复孔，试验重复3 次。

1.5 Western blot 取1.3 中的各组细胞，经2.5 g／L胰蛋白酶消化，1 000 r／min 离心5 min，加入蛋白质裂解液，冰上裂解40 min，12 000 r／min 离心5 min，收集上清液，采用BCA 法测定总蛋白质浓度。每孔取35 μg 蛋白质加样，行10 g／L SDS-PAGE 凝胶电泳。电泳结束后，300 mA 恒流1.5 h 将蛋白质转移至PVDF 膜，加入50 g／L 脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入兔抗人USP26、MDA5、IRF3、磷酸化IRF3、GAPDH 抗体、兔抗EV71／VP1 抗体（均为1 ∶1 000稀释），4 ℃过夜；TBST 洗膜3 次，每次5 min，再加入HRP 标记的羊抗兔lgG 抗体（1 ∶1 000稀释）室温1 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min，采用ECL 发光液显色，在CLINX 化学发光成像仪中显影，应用凝胶图像分析系统及Image J 软件对条带进行灰度扫描及结果判读。试验重复3 次。

1.6 细胞转染试验 将生长状态良好的RD 细胞接种于6 孔细胞培养板，待细胞融合度达40%时，先混合SiRNA 与转染试剂Lipofectamine 3000（1 ∶1混合），弃去原培养基，加入新的培养基继续培养24～48 h，每隔12 h 用荧光显微镜观察转染效率，待细胞转染率达90%时，即完成转染。

1.7 空斑试验检测病毒滴度 将RD 细胞密度调整为1×105／mL，接种于6 孔细胞培养板，每孔加入2 mL 培养过夜，次日参照1.6 的转染方法转染相应的USP26-siRNA（实验组）或siRNA（对照组），转染48 h 后感染EV71（MOI ＝1），用1 mL 培养基继续培养；病毒感染24 h 后用细胞刮刮下细胞，连同上清液一起收集，细胞碎片及上清液置于-80 ℃保存备用。将RD 细胞密度调整为1×104个／孔，接种于96 孔细胞培养板，每孔100 μL，培养细胞融合度达80%～90%。将收集的病毒液进行100～109倍比稀释，弃去原培养基并将稀释好的病毒液加入至培养孔中（100 μL／孔），每个稀释倍数设置3 个复孔，继续培养24 h；选取空斑数目合适的同一稀释倍数，弃去病毒液并用PBS 洗涤细胞，每孔加入30 μL 3%的结晶紫溶液（称取结晶紫3 g 溶于70%乙醇中）染色10 min，弃去染液于生物安全柜中风干，光学显微镜下计数空斑数目并计算病毒滴度。

1.8 统计学分析 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，GraphPad Prism8 软件作图。计量资料以表示，所有计量资料均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验，多个样本均数进行单因素方差分析（One-way ANOVA），各均数间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EV71 感染RD 细胞后USP26 的表达情况

2.1.1 RT-PCR 检测EV71 感染RD 细胞后USP26mRNA 及VP1mRNA 的表达水平 与0 h（1.02±0.02）相比，EV71 感染RD 细胞2、4、8、12 和24 h时USP26mRNA 的表达水平显著升高（分别为1.17±0.03、2.67±0.32、9.28±0.14、11.39±0.52 和4.61±0.58），差异均有统计学意义（t分别为4.62、4.98、57.23、19.84 和6.22，P均＜0.05）；此外，VP1mRNA在0、2 和4 h 时均不表达，而在8、12 和24 h 时的表达水平分别为1.64±0.12、6.67±0.48 和9.68±0.58。

2.1.2 Western blot 检测EV71 感染RD 细胞后UPS26 蛋白和VP1 蛋白表达水平 相对于0 h（0.21±0.01），EV71 感染RD 细胞4、8、12 和24 h时USP26 蛋白的灰度比值（分别为0.25±0.01、0.38±0.01、0.43±0.01 和0.44±0.02）均显著升高（t分别为3.22、10.35、12.29 和11.18，P＜0.05），而2 h USP26 蛋白的灰度比值（0.23±0.01）与0 h 比较差异无统计学意义（t＝1.36，P＞0.05）；此外，VP1 蛋白在0、2 和4 h 时均不表达，而在8 h、12 和24 h 时的灰度比值分别为0.24±0.03、0.58±0.06 和0.87±0.06。见图1。

图1 EV71 感染诱导USP26 的表达上调

2.2 敲减USP26后USP26、VP1mRNA 的表达

2.2.1 RT-PCR 检测敲减USP26后USP26mRNA的表达水平 与对照组的USP26mRNA 的表达水平（1.05±0.07）比较，USP26-siRNA1、USP26-siRNA2 和USP26-siRNA3 敲减后，USP26mRNA 的表达水平分别为0.27±0.08、0.64±0.03和0.45±0.05（t分别为9.69、5.14 和6.74，P＜0.05），以USP26-siRNA1 敲减效果最明显，故而用于后续试验。

2.2.2 RT-PCR 检测实验组（UPS26-siRNA1 敲减组）和对照组中VP1mRNA 的表达水平 与0 h 比较，对照组在8、12 和24 h 时VP1mRNA 的表达水平逐渐增多；实验组与对照组VP1mRNA 表达水平结果趋势一致，但与对照组中同一时间点（8、12 和24 h）比较，VP1mRNA 的表达水平减低，差异有统计学意义（t分别为6.88、5.24 和5.58，P＜0.05）。见表3。

表3 UPS26 敲减组和对照组中VP1 mRNA 的表达水平

2.2.3 空斑试验检测病毒滴度结果 与对照组（转染siRNA 组）病毒滴度［（8.76±0.47）×105PFU／mL］比较，实验组（转染UPS26-siRNA 组）病毒滴度［（5.39±0.20）×105PFU／mL］显著降低，差异有统计学意义（t＝6.51，P＜0.05）。

2.3 USP26 负性调控RLR 信号通路 在EV71 的感染过程中，对照组8 h 宿主细胞中MDA5 蛋白（灰度比值为0.19±0.01）的表达水平下降［与0 h对照组（0.28±0.01）比较，t＝6.05，P＜0.05］，实验组8 h 时MDA5 蛋白（灰度比值为0.26±0.01）水平变化差异无统计学意义［与0 h 实验组（灰度比值为0.27±0.01）比较，t＝0.20，P＞0.05］；对照组8 h 时p-IRF3／IRF3 的相对比值为0.08±0.02，实验组p-IRF3／IRF3的相对比值为0.36±0.03，两组间差异有统计学意义（t＝7.71，P＜0.05）；与对照组8 h 比较，实验组8 h 宿主细胞中VP1 蛋白的表达量明显减少（0.32±0.06 vs 0.83±0.08，t＝5.08，P＜0.05）。见图2。

图2 USP26 负性调控RLR 信号通路

3 讨论

VP1 蛋白是构成EV71 外壳蛋白主要成分之一，参与病毒的吸附、穿入、脱壳等过程。在EV71病毒感染RD 细胞过程中，笔者发现从8 h 时开始表达VP1，24 h 时达到峰值，而Kuo 等［7］报道VP1可以在感染Hela 细胞6 h 后表达。虽然EV71 在Hela 细胞中更容易增殖，但Hela 细胞增殖效率明显低于RD 细胞，在细胞实验中不具有优势。因此，不同的EV71 毒株类型、感染滴度以及细胞系可能导致VP1 蛋白表达水平及出现时间存在差异。

MDA5 受体是识别EV71 的主要受体之一，可活化干扰素调节因子IRF3，诱导抗病毒蛋白的产生，发挥细胞的抗病毒作用［7］。EV71 病毒含有2个重要蛋白酶，分别为2A 和3C，其可通过降解细胞中关键蛋白，抑制细胞的免疫反应。Feng 等［6］研究发现，2A 蛋白酶通过降解RLR 信号通路中关键蛋白MDA5 和MAVS，从而逃逸机体的免疫应答。本研究发现EV71 感染能够抑制宿主细胞中MDA5 的表达，但是否为2A 蛋白酶降解作用，尚需要进一步验证。

宿主细胞可通过去泛素化酶调控抗病毒信号通路中的关键蛋白质分子，对病毒感染检测具有重要意义。多项研究证实了RLR 信号通路中关键蛋白分子受到去泛素化酶的调节，例如USP4 可通过特异性去除RIG-I 蛋白的K-48 泛素连接，从而稳定RIG-I 蛋白，发挥正向调节RLR 抗病毒信号通路的作用［8］；同样，EV71 也会利用去泛素化酶调控RLR 信号通路，从而抑制细胞的抗病毒作用，逃逸机体的免疫应答。Gu 等［9］发现USP19 通过靶向抑制TRAF3 分子的K-63 多聚泛素化修饰，从而抑制IFN-I 天然免疫信号中IRF3 的磷酸化。本课题组前期研究发现USP24 能够特异性结合TBK1 蛋白，减少与K-63 泛素的修饰，抑制IRF3 的磷酸化，促进病毒的复制［10］。此外，笔者还发现随着EV71 感染时间延长，USP26 的表达也随之上调；通过基因敲减USP26的表达，细胞中的VP1mRNA 和VP1蛋白明显受到抑制，而空斑试验中USP26 的敲减能降低EV71 的病毒滴度。进一步研究发现抑制细胞中USP26 的表达，能够抑制病毒降解MDA5 蛋白的作用，同时IRF3 磷酸化增加。因此，USP26 表达的增加或降低对EV71 的复制具有重要的调节作用。

综上所述，USP26 可能通过结合RLR 信号通路中关键蛋白，调控蛋白质的泛素化修饰，引起蛋白质活化或失活，进而影响EV71 在宿主细胞中的复制，为临床治疗手足口病提供新的实验依据。本课题研究仍然还有一些问题值得更深入地探讨，例如一方面需要寻找作用的靶蛋白；另一方面，本研究的层次仅局限于细胞水平，那么EV71 在感染小鼠实验过程中，是否具有同样的结果？USP26 是否还影响其他病毒增殖？这是笔者今后研究工作中的重点。