田蓟苷通过激活AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞铁死亡*

陈 云,胡立杰,王婷婷,郝明明

1.衡水市第四人民医院综合儿科,河北衡水 053000;2.衡水市第四人民医院药剂科,河北衡水 053000;3.衡水市人民医院小儿内科,河北衡水 053000

儿童急性肺损伤(ALI)是儿童重症监护病房中的常见疾病,是肺部炎症反应综合征,发病率和病死率较高,严重威胁着儿童的生命健康安全。ALI生理病理特征表现为免疫细胞过度激活、氧化应激、炎症等,肺泡上皮细胞死亡是ALI的显著特征,肺泡上皮细胞损伤还是评估ALI预后的重要指标。ALI患者如不及时治疗可能转成急性呼吸窘迫综合征(ARDS),ALI/ARDS是导致急性呼吸衰竭的主要原因[1-2]。目前虽然对ALI/ARDS研究和治疗有了很大的进展,但治疗带来的不良反应依然不能避免,这严重降低了患者的生存质量。因此,积极深入探索ALI/ARDS的发病机制对开发新的治疗ALI/ARDS的药物至关重要[3]。

田蓟苷是从香青兰中提取出来的,它是一种天然活性成分。据报道,田蓟苷可调节与氧化应激介导的炎症、凋亡和血管生成相关的细胞信号转导途径中的许多关键元素,对心脏保护、神经保护、抗动脉粥样硬化、抗高血压、抗糖尿病等方面起着重要作用[4]。研究发现,田蓟苷是改善脂多糖(LPS)诱导的ALI的潜在药物,在体外试验中,田蓟苷减少了LPS诱导的巨噬细胞促炎因子分泌,在ALI模型小鼠体内,田蓟苷的预防性治疗减弱了巨噬细胞的浸润和组织病理学变化[5]。研究发现,激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)信号通路,可抑制炎症及肺组织细胞凋亡,从而减轻百草枯引起的ALI[6]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)在M2巨噬细胞中高表达能保护脓毒症引起的ALI[7]。但是,田蓟苷通过调节AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路对LPS诱导的肺泡上皮细胞铁死亡的影响尚不清楚。因此,本研究旨在探讨田蓟苷对LPS诱导肺泡上皮细胞铁死亡的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 人肺泡上皮细胞BEAS-2B购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2主要试剂与仪器 田蓟苷标准品(纯度≥98%)购自北京英莱克科技发展有限公司,LPS购自北京康瑞纳生物科技有限公司,还原型谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司,DCFH-DA活性氧(ROS)荧光探针购自北京索莱宝科技有限公司,蛋白提取试剂盒购自亚科因(武汉)生物公司,铁离子检测试剂盒、MDA检测试剂盒、兔源一抗GPX4、PCNA、Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、GAPDH抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗均购自美国Abcam公司,兔源一抗AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)、SIRT1、PGC-1α抗体均购自Proteintech公司,DMEM培养基购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司,兔源一抗Tf抗体购自上海西格生物科技有限公司,多功能全自动酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司,离心机购自艾本德中国有限公司,电泳仪购自美国Bio-Rad公司,流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3方法

1.3.1BEAS-2B细胞培养 将BEAS-2B细胞接种至DMEM培养基中(含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素),在恒温培养箱中常规培养,培养条件为37 ℃、5% CO2。定期观察,及时更换新的培养基。当BEAS-2B细胞融合度达到85%左右时,用0.25%胰蛋白酶消化传代,收集对数生长期的BEAS-2B细胞进行下一步实验。

1.3.2LPS诱导与分组 将对数生长期的BEAS-2B细胞分为6组:对照组、LPS组、田蓟苷低剂量组、田蓟苷中剂量组、田蓟苷高剂量组、Compound C(ComC)抑制剂组。除对照组外,首先将其余组细胞给予10 μg/mL[8]的LPS刺激24 h,然后将田蓟苷低、中、高剂量组分别采用20、50、100 μmol/L[9]的田蓟苷处理24 h,ComC抑制剂组采用100 μmol/L的田蓟苷和10 μmol/L的AMPK抑制剂[10]共同处理24 h。

1.3.3四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测BEAS-2B细胞增殖 将各组细胞以1×104/孔接种到96孔板中,于5%CO2、37 ℃细胞培养箱中孵育,设6个复孔,分别培养24、48、72 h后,每孔加入MTT溶液20 μL,再培养4 h后,每孔加入二甲基亚砜150 μL,充分振荡后,在酶标仪上于490 nm波长处检测各孔的吸光度(A490)值。

1.3.4流式细胞仪检测BEAS-2B细胞凋亡 首先收集各组BEAS-2B细胞,然后预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,随后,将细胞制成1×106/mL的悬液。最后,加入5 μL的Annexin V-FITC和PI染液。充分混匀这些液体。在室温下遮光染色15 min,采用流式细胞仪检测各组BEAS-2B细胞凋亡。

1.3.5BEAS-2B细胞内还原型GSH、ROS、MDA、Fe2+水平测定 收集各组BEAS-2B细胞悬液,制成匀浆后操作严格按照还原型GSH、MDA、Fe2+试剂盒说明书进行检测细胞内还原型GSH水平、MDA的水平、Fe2+水平,采用DCFH-DA荧光染料通过流式细胞术检测细胞ROS水平。

1.3.6Western blotting法检测蛋白表达 首先提取各组BEAS-2B细胞总蛋白,然后对各组BEAS-2B的总蛋白定量,接着进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,室温条件下封闭2 h,分别加入GPX4、Tf、PCNA、Bax、caspase-3、AMPK、p-AMPK、SIRT1、PGC-1α一抗,4 ℃条件下孵育过夜,加入二抗,室温条件下孵育90 min。以GAPDH作为内源性对照。用Image J软件分析各个蛋白条带的灰度值,然后计算各个蛋白的相对表达水平。

2 结 果

2.1各组BEAS-2B细胞增殖能力比较 与对照组相比,LPS组BEAS-2B细胞的A490值降低(P<0.05);与LPS组比较,田蓟苷低、中、高剂量组BEAS-2B细胞的A490值升高(P<0.05);与田蓟苷高剂量组比较,ComC抑制剂组BEAS-2B细胞的A490值降低(P<0.05)。见图1。

注:与对照组相比,aP<0.05;与LPS组相比,bP<0.05;与田蓟苷低剂量组相比,cP<0.05;与田蓟苷中剂量组相比,dP<0.05;与田蓟苷高剂量组相比,eP<0.05。图1 各组BEAS-2B细胞A490值比较

2.2各组BEAS-2B细胞凋亡情况比较 与对照组相比,LPS组BEAS-2B细胞的凋亡率升高(P<0.05);与LPS组比较,田蓟苷低、中、高剂量组BEAS-2B细胞的凋亡率降低(P<0.05);与田蓟苷高剂量组比较,ComC抑制剂组BEAS-2B细胞的凋亡率升高(P<0.05)。见图2。

注:与对照组相比,aP<0.05;与LPS组相比,bP<0.05;与田蓟苷低剂量组相比,cP<0.05;与田蓟苷中剂量组相比,dP<0.05;与田蓟苷高剂量组相比,eP<0.05。图2 各组BEAS-2B细胞凋亡情况比较

2.3各组BEAS-2B细胞内还原型GSH、ROS、MDA、Fe2+水平比较 与对照组相比,LPS组BEAS-2B细胞的还原型GSH水平显著降低,ROS、MDA、Fe2+水平显著升高(P<0.05);与LPS组比较,田蓟苷低、中、高剂量组BEAS-2B细胞的还原型GSH水平显著升高,ROS、MDA、Fe2+水平显著降低(P<0.05);与田蓟苷高剂量组比较,ComC抑制剂组BEAS-2B细胞的还原型GSH水平显著降低,ROS、MDA、Fe2+水平显著升高(P<0.05)。见图3。

注:与对照组相比,aP<0.05;与LPS组相比,bP<0.05;与田蓟苷低剂量组相比,cP<0.05;与田蓟苷中剂量组相比,dP<0.05;与田蓟苷高剂量组相比,eP<0.05。图3 各组细胞中还原型GSH、ROS、MDA、Fe2+水平比较

2.4各组BEAS-2B细胞中GPX4、Tf、PCNA、Bax、caspase-3蛋白表达比较 与对照组相比,LPS组BEAS-2B细胞的GPX4、PCNA蛋白表达显著降低(P<0.05),Tf、Bax、caspase-3蛋白表达升高(P<0.05);与LPS组比较,田蓟苷低、中、高剂量组BEAS-2B细胞的GPX4、PCNA蛋白表达显著升高(P<0.05),Tf、Bax、caspase-3蛋白表达降低(P<0.05);与田蓟苷高剂量组比较,ComC抑制剂组BEAS-2B细胞的GPX4、PCNA蛋白表达显著降低(P<0.05),Tf、Bax、caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)。见图4。

注:A为对照组;B为LPS组;C为田蓟苷低剂量组;D为田蓟苷中剂量组;E为田蓟苷高剂量组;F为ComC抑制剂组。图4 Western blotting检测细胞中GPX4、Tf、PCNA、Bax、caspase-3蛋白表达

2.5各组BEAS-2B细胞AMPK/SIRT1/PGC-1α通路蛋白表达比较 与对照组相比,LPS组BEAS-2B细胞的p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达显著降低(P<0.05);与LPS组比较,田蓟苷低、中、高剂量组BEAS-2B细胞的p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达显著升高(P<0.05);与田蓟苷高剂量组比较,ComC抑制剂组BEAS-2B细胞的p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图5。

注:A为对照组;B为LPS组;C为田蓟苷低剂量组;D为田蓟苷中剂量组;E为田蓟苷高剂量组;F为ComC抑制剂组。图5 Western blotting法检测BEAS-2B细胞AMPK/SIRT1/PGC-1α通路蛋白表达

3 讨 论

ALI是一种由长期炎症和不受控制的氧化应激引起的肺部疾病,肺泡上皮细胞急性损伤是ALI的主要病理特征,所以修复或改善肺泡上皮细胞急性损伤是治疗ALI的重点[11]。LPS是革兰阴性细菌细胞壁外膜的主要成分,研究发现LPS能诱导ALI,使ROS积累,诱导铁死亡的参与[12]。细胞发生铁死亡时,GPX4蛋白水平降低,使得ROS积累,同时细胞内还原型GSH水平下降,脂质过氧化产物、游离铁、Tf水平升高[13]。本研究结果发现,与对照组相比,LPS组BEAS-2B细胞的A490值、铁死亡指标(还原型GSH水平、GPX4蛋白)及PCNA蛋白表达显著降低,凋亡率、铁死亡指标(ROS、MDA、Fe2+水平、Tf蛋白)及凋亡蛋白(Bax、caspase-3)表达显著升高(P<0.05)。这表明LPS能抑制BEAS-2B细胞增殖,促进BEAS-2B细胞凋亡、铁积累和氧化应激,与相关研究结果相一致[12-13],提示LPS诱导的上皮细胞铁死亡模型构建成功。

AMPK不仅是调节生物能量代谢的关键分子,还能调节细胞凋亡和氧化应激。SIRT1参与调节细胞周期调控(如细胞增殖、凋亡、衰老)、氧化应激、能量代谢、炎症等多种细胞信号通路。激活的AMPK可监测线粒体功能和细胞能量状态,还能调节SIRT1的活性,AMPK和SIRT1的下游靶蛋白是PGC-1α,激活的AMPK和SIRT1可调节PGC-1α活性,使其表达上调[14-15]。有研究发现,miR-155能通过提高SIRT1蛋白表达,减轻LPS诱导的ALI大鼠的肺部炎症,同时能减少大鼠肺组织细胞凋亡[16]。人脐带间充质干细胞上清液通过提高p-AMPK/AMPK蛋白表达,减少炎性因子和中性粒细胞比例,从而降低并改善LPS诱导的ALI[17]。IL-10通过激活AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路,上调AMPK、SIRT1和PGC-1α的mRNA及蛋白表达,以减少氧化应激和细胞凋亡,从而保护肺组织免受细颗粒物(PM2.5)诱导发生ALI[18]。

田蓟苷来源于香青兰,属于黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗高血压等功效[19]。有研究发现,在ALI小鼠模型中,田蓟苷可以降低氧化应激与炎症反应,从而改善LPS诱导的ALI[5]。田蓟苷可以通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路改善线粒体能量代谢和减少氧化应激,ComC(AMPK抑制剂)和EX-527(SIRT1抑制剂)能消除这些改善[20]。

本研究结果发现,与LPS组比较,田蓟苷低、中、高剂量组BEAS-2B细胞的A490值、还原型GSH水平、GPX4、PCNA、p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达显著升高(P<0.05),凋亡率、ROS、MDA、Fe2+、Tf、Bax、caspase-3表达显著降低(P<0.05)。这说明田蓟苷可以激活AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路,抑制LPS诱导的细胞凋亡、铁积累和氧化应激,促进BEAS-2B细胞增殖,而使用AMPK抑制剂可ComC减弱田蓟苷对BEAS-2B细胞增殖的促进作用,增强细胞凋亡、铁积累和氧化应激。这些结果提示田蓟苷确实可以通过激活AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路抑制LPS诱导的BEAS-2B细胞铁死亡。

综上所述,田蓟苷可通过激活AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路,抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞铁死亡,其可能是具有开发前景的治疗ALI的药物。当然,本研究尚存在不足之处,仅在BEAS-2B一种细胞株上验证了田蓟苷调控AMPK/SIRT1/PGC-1α通路对肺泡上皮细胞铁死亡的影响,未在原代细胞中进行验证,并且本研究中未设置SIRT1和PGC-1α抑制组,这将作为后续的研究内容。