miR-218-5p/ GTSE1调控轴抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭

王攀登,刘 涛,2,张 天,吴 鲧

(1.广西中医药大学附属国际壮医医院 心胸血管外科,广西 南宁 530001;2.广西医科大学第一附属医院 胸心外科,广西 南宁 530001)

肺癌作为全球最常见的恶性肿瘤之一［1],主要包括小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)及非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)两大类,非小细胞肺癌中最为普遍的为肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)［2]。近年来,尽管各种诊断、治疗方法均有大幅度的提高,但肺癌患者的5年生存率仅为 16%左右［3]。G2期/S期应答相关蛋白1(G2and S phase-expressed-1,GTSE1)是由人GTSE1基因编码的细胞周期相关蛋白,主要调节G1/ S细胞周期的过渡［4]。研究表明GTSE1在几种癌症中都表现为表达上调,并且GTSE1的敲除能够减少癌细胞的增殖、迁移和侵袭［5-9]。GTSE1在肝细胞癌中与不良预后相关,预示GTSE1可能代表了有希望的分子靶标［10]。但是,GTSE1在肺腺癌中的表达情况、作用机制以及生存预后关系尚不明确。本研究分析了GTSE1在肺腺癌中的表达情况及与预后的关系,挖掘了GTSE1上游调控miRNA,并且通过体外实验验证了GTSE1的作用机制,目的是探索肺腺癌的发病机制,为靶向治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料 胎牛血清、RPMI-1640培养基、细胞外基质凝胶购自美国Sigma公司;sh-NC、sh-GTSE1、oe-NC、oe-GTSE1、miR-218-5p mimic和mimic NC、miR-218-5p inhibitor和inhibitor NC均购自美国Genecopoeia公司;Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司;Trizol试剂、BCA蛋白检测试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司;逆转录试剂盒购自德国DBI Bioscience公司;SYBR-Green PCR Master Mix试剂盒购自德国QIAGEN公司;蛋白酶抑制剂购自中国博奥森公司;放射免疫沉淀实验缓冲液、细胞增殖试剂CCK8购自中国碧云天公司;PVDF膜上购自美国Millipore公司;一抗兔多克隆抗体GTSE1、双荧光素酶检测试剂盒购自美国Proteintech公司;一抗兔单克隆抗体GAPDH及二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)购自英国Abcam公司;pGL3启动子载体购自中国金斯瑞公司;海肾荧光素酶表达载体pRL-TK购自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 本研究所使用细胞系信息如下:人支气管上皮细胞BEAS-2B(BNCC338205)和人肺腺癌细胞系PC-9(BNCC340767),A549(BNCC341254),PAa(BNCC341415),Calu-3(BNCC338514)均购自中国北纳生物公司。所有细胞系均在含有10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基中,于37 ℃,5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染 将2×105个肺腺癌细胞接种于六孔板中,待细胞生长至60%左右时,根据说明书,使用Lipofectamine 2000对细胞进行转染。细胞转染48 h后,用于下一步实验。

1.2.3 RNA提取及qRT-PCR 用Trizol法提取细胞中的总RNA。取1 μg总RNA合成cDNA,即通过逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。利用SYBR-Green PCR Master Mix试剂盒进行实时定量扩增。使用ABI 7500 Real-Time PCR系统进行qRT-PCR反应检测。U6和GAPDH分别作为miR-218-5p和GTSE1的内参。引物序列见表1,结果使用2-ΔΔCt值来量化和归一化处理。

1.2.4 蛋白免疫印迹 肺腺癌细胞中的总蛋白在含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀实验缓冲液中裂解。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。将等量的蛋白用15% SDS-PAGE分离,转移到PVDF膜上,5%脱脂乳室温封闭1 h,与一抗4 ℃下过夜。随后,在室温下用二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)孵育1 h。最后于光学发光仪扫描显影。抗体信息如下:一抗兔多克隆抗体GTSE1(21319-1-AP,1∶4 000),一抗兔单克隆抗体GAPDH(ab181602,1∶10 000),二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP,ab205718,1∶20 000)。

1.2.5 CCK8实验 在96孔板中接种100 μL浓度为4×104个/mL转染成功的肺腺癌细胞悬液,在培养箱中分别培养24 、48 、72 、96 h。在检测之前,加入10 μL/孔细胞增殖试剂CCK8并在37 ℃和5% CO2下孵育4 h。根据制造商说明,使用SpectraMax M5在450 nm波长下测量各组的吸光度。

1.2.6 细胞克隆实验 转染后的细胞系以每孔1 500个细胞接种到6孔板中,在含有10% FBS的RPMI-1640培养基中37 °C培养,培养基每3天更换1次。标准培养14 d后,用乙醇固定,再用0.1%结晶紫染色,计算细胞克隆形成数,重复实验进行3次。

1.2.7 迁移与侵袭实验 迁移实验:胰蛋白酶分离肺腺癌细胞后,PBS洗涤,在无血清培养基中重悬。上室接种肺腺癌细胞(1×104/孔),在下室添加含10% FBS的RPMI-1640培养基。24 h后,去除过滤器上表面未迁移的细胞,用0.5%结晶紫染色并在显微镜下随机选取5个视野观察并拍照。细胞侵袭实验步骤与迁移实验一致,不一样的是侵袭实验需要在上室涂20 μg细胞外基质凝胶。

1.2.8 双荧光素酶报告基因实验 将野生型GTSE1 3′UTR序列和突变型GTSE1 3′UTR序列插入pGL3启动子载体,构建GTSE1-WT和GTSE1-MUT报告基因质粒。海肾荧光素酶表达载体pRL-TK作为内参。转染36 h后,使用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。

1.2.9 生信分析 从TCGA-LUAD中下载肺腺癌的mRNA的表达量数据(正常样本为46,肿瘤样本为521)、miRNA成熟体数据(正常样本为59,肿瘤样本为535)和临床数据,利用“edgeR”包miRNA进行正常样本组和肿瘤样本组的差异分析(|logFC|>1.5,padj<0.05)获得差异miRNA,利用“survival”对目标mRNA进行生存分析,利用starBase(http://starbase.sysu.edu. cn/index.php)数据库预测靶基因mRNA的上游miRNA,并与下调的DEGs取交集,通过Pearson相关性分析确定目标基因miRNA。

2 结果

2.1GTSE1在肺腺癌细胞系中高表达 由TCGA-LUAD中肺腺癌的mRNA表达量数据和临床数据分析结果显示,GTSE1在肺腺癌组织中显著高表达(图1A),与stage Ⅰ+Ⅱ组相比,stage Ⅲ+Ⅳ组肺腺癌患者的GTSE1表达显著升高(图1B),且生存分析显示与GTSE1低表达患者相比,GTSE1高表达的患者生存率显著降低(图1C)。为了探讨GTSE1在肺腺癌恶性进展中的潜在作用,检测了GTSE1在不同人肺腺癌细胞系中的表达。qRT-PCR检测结果如图1D所示,与人支气管上皮细胞系(BEAS-2B)相比,GTSE1在人肺腺癌细胞系(PC-9、 A549、 PAa、Calu-3)中的mRNA表达量均显著升高。Western blot实验结果显示肺腺癌细胞系中GTSE1的蛋白表达水平与人支气管上皮细胞系(BEAS-2B)相比显著增加(图1E),结果证实GTSE1在肺腺癌中高表达。之后,选择表达相对较高的PC-9和表达相对较低的A549进行后续的体外实验。

A:GTSE1在正常组织和肿瘤组织中的表达情况,蓝色箱图表示正常样本,红色箱图表示肿瘤样本;B:stage Ⅰ+Ⅱ组和stage Ⅲ+Ⅳ组肺腺癌患者的GTSE1的表达情况,蓝色小提琴图表示stage Ⅰ+Ⅱ组患者,橙色小提琴图表示stage Ⅲ+Ⅳ组患者;C:GTSE1表达量对肺腺癌患者生存期的影响,红色为高表达组,蓝色为低表达组;D:qRT-PCR检测在肺腺癌细胞系及人支气管上皮细胞中GTSE1的mRNA表达水平;E、F:Western blot检测在肺腺癌细胞系及人支气管上皮细胞中GTSE1的的蛋白表达水平。图1 GTSE1在肺腺癌中高表达与患者生存预后相关

2.2 高表达的GTSE1能够促进肺腺癌细胞的增殖 在肺腺癌细胞系PC-9和A549中分别过表达和抑制GTSE1的表达,并用qRT-PCR和Western blot检测转染效率,结果显示与sh-NC组相比,肺腺癌细胞的sh-GTSE1组中GTSE1表达显著下调;与oe-NC组相比,oe-GTSE1组中GTSE1表达显著上调(图2A),说明转染效果较好,可用于后续实验。接着,通过细胞功能实验分析GTSE1对肺腺癌细胞恶性进展的影响。CCK8实验检测结果显示,在GTSE1表达抑制的肺腺癌细胞系中,细胞活力显著降低(图2B);而过表达GTSE1后,细胞活力显著提升(图2C)。克隆形成实验检测结果显示,在GTSE1表达抑制的PC-9和A549细胞中,细胞增殖被显著抑制(图2D);反之,在GTSE1过表达的PC-9和A549细胞中,细胞增殖能力显著提升(图2E),与CCK8实验结果一致。由此可见GTSE1可能在肺腺癌进展过程中发挥促癌作用,影响癌症进程。

A:通过qRT-PCR和Western blot检测转染后的PC-9和A549细胞系中GTSE1的mRNA和蛋白表达水平;B:CCK8检测sh-GTSE1组及对照组的细胞活力;C:CCK8检测oe-GTSE1组及对照组的细胞活力;D:克隆形成实验检测sh-GTSE1组及对照组的细胞克隆形成能力;E:克隆形成实验检测oe-GTSE1组及对照组的细胞克隆形成能力;与sh-NC组、oe-NC组比较,*:P<0.05;**:P<0.01。图2 高表达的GTSE1能够促进肺腺癌细胞的增殖

2.3 高表达的GTSE1能够促进肺腺癌细胞的迁移与侵袭 癌症的重要特征之一就是癌细胞能够向远处扩张,而细胞迁移和侵袭是这一过程中的重要步骤。因此,在实验中分别使用了没有基质凝胶和有基质凝胶的Transwell方法来研究细胞的迁移和侵袭。从图3A中可以看到,与sh-NC相比较,转染sh-GTSE1的PC-9和A549细胞中迁移细胞数量显著下降;反之,转染oe-GTSE1的PC-9和A549细胞中迁移细胞数量显著多于oe-NC组。同样地,与sh-NC组相比,sh-GTSE1组肿瘤细胞的侵袭能力受到显著抑制;而与oe-NC组相比,oe-GTSE1组肿瘤细胞的侵袭能力显著增强(图3B)。由此可见,GTSE1参与了肺腺癌细胞迁移和侵袭的调控,可促进肺腺癌细胞的迁移与侵袭。

2.4GTSE1是miR-218-5p下游调控的靶点 为进一步探究GTSE1对肺腺癌的分子调控机制,从TCGA-LUAD中下载肺腺癌的miRNA成熟体,并利用“edgeR”包分别对正常样本组和肿瘤样本组的miRNA进行差异分析(|logFC|>1.5,padj<0.05),共获得184个差异miRNA(其中上调145个,下调39个,图4A)。 接着,通过starBase数据库预测GTSE1的上游目标miRNA,将预测结果与下调的39个差异miRNA取交集,获得3个与GTSE1具有靶向结合位点的差异miRNA(图4B)。对GTSE1与这3个miRNA进行Pearson相关性分析,发现miR-218-5p与GTSE1负相关性最高(图4C),且分析发现miR-218-5p在肺腺癌组织中极显著低表达(图4D)。与stage Ⅰ+Ⅱ组相比,stage Ⅲ+Ⅳ组肺腺癌患者的miR-218-5p表达无显著差异(图4E),生存分析结果表明miR-218-5p低表达的肺腺癌患者与高表达患者相比生存率无显著差异(图4F)。同时,通过qRT-PCR在细胞中进一步验证,实验结果显示与人支气管上皮细胞系(BEAS-2B)对照比较,miR-218-5p在4株肺腺癌细胞系中均呈现出显著低表达(图4G),这与在组织中的分析结果一致。因此选择miR-218-5p作为后续研究对象。

A:Transwell迁移实验检测sh-GTSE1及sh-NC,oe-GTSE1及oe-NC处理肺腺癌细胞系(PC-9和A549)后对细胞迁移能力的影响(×100);B:Transwell侵袭实验检测sh-GTSE1及sh-NC,oe-GTSE1及oe-NC处理肺腺癌细胞系(PC-9和A549)后对于细胞侵袭能力的影响(×100)。图3 高表达的GTSE1能够促进肺腺癌细胞的迁移与侵袭

为了验证miR-218-5p与GTSE1的靶向结合关系,本研究构建了野生型和突变型荧光素酶报告载体,并将这些质粒和NC mimic、miR-218-5p mimic共转染到A549细胞中,随后进行双荧光素酶报告基因检测。结果显示,过表达miR-218-5p会显著降低野生型GTSE1 3′-UTR荧光素酶活性,而对突变型GTSE1 3′-UTR荧光酶素活性没有影响(图4H)。接着,将mimic NC,miR-218-5p mimic,inhibitor NC,miR-218-5p inhibitor分别转染至肺腺癌细胞PC-9和A549中,检测细胞中GTSE1的mRNA和蛋白表达水平,发现过表达miR-218-5p时GTSE1的表达显著下降,而抑制miR-218-5p表达时GTSE1的表达则显著上升(图4I～J)。因此,认为在肺腺癌中,miR-218-5p靶向下调GTSE1的表达。

2.5 miR-218-5p通过下调GTSE1来抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭 在肺腺癌细胞系中,已经证实了miR-218-5p为低表达,接着为了更好的验证miR-218-5p在肺腺癌细胞中是否发挥抑癌作用及对GTSE1的调控作用,本研究进行了一系列细胞功能实验。首先,构建了以下分组:mimic NC+oe-NC,mimic NC+oe-GTSE1,miR-218-5p mimic+oe-NC,miR-218-5p mimic+oe-GTSE1,并用qRT-PCR和Western blot检测GTSE1的表达情况,结果显示单独过表达GTSE1后GTSE1的mRNA和蛋白表达水平显著上升,单独过表达miR-218-5p后GTSE1的mRNA和蛋白表达水平显著下调,而同时过表达miR-218-5p和GTSE1后GTSE1表达得到恢复(图5A)。CCK8和细胞克隆形成实验中,可以看到转染oe-GTSE1后肿瘤细胞的活力和克隆形成能力显著升高,转染miR-218-5p mimic的PC-9和A549细胞系中,癌细胞的活力与克隆形成能力均显著下降;但是,在miR-218-5p和GTSE1同时过表达时,细胞的增殖和克隆形成能力得到了明显的恢复,恢复到mimic NC+oe-NC组水平(图5B、C)。此外,本研究也对各转染组细胞的迁移与侵袭能力也进行检测,结果如图5D、E所示,与mimic NC+oe-NC组相比,mimic NC+oe-GTSE1组的迁移和侵袭能力均显著增强,miR-218-5p mimic+oe-NC组的迁移与侵袭能力均被显著抑制,而在转染组miR-218-5p mimic+oe-GTSE1中,癌细胞的迁移与侵袭能力恢复至mimic NC+oe-NC组水平相当。因此,认为miR-218-5p能够抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭,而GTSE1过表达处理可以恢复部分抑制作用。

A:肺腺癌数据集中正常样本组和肿瘤样本组的差异miRNA火山图,红点代表上调基因,绿点代表下调基因;B:GTSE1预测的上游miRNA和差异下调miRNA的维恩图;C: GTSE1和差异miRNA的Pearson相关性分析;D: miR-218-5p在正常组织和肿瘤组织中的表达情况,蓝色箱图表示正常样本,红色箱图表示肿瘤样本;E:stage Ⅰ+Ⅱ组和stage Ⅲ+Ⅳ组肺腺癌患者的miR-218-5p的表达情况,蓝色小提琴图表示stage Ⅰ+Ⅱ组患者,橙色小提琴图表示stage Ⅲ+Ⅳ组患者;F:miR-218-5p表达量对肺腺癌患者生存期的影响,红色为高表达组,蓝色为低表达组;G: qRT-PCR检测miR-218-5p在肺腺癌细胞系及人支气管上皮细胞中的mRNA表达水平;H: 双荧光素酶报告基因实验验证GTSE1能否靶向结合miR-218-5p;I:qRT-PCR检测过表达/敲低miR-218-5p对GTSE1的mRNA表达的影响;J: Western blot检测过表达/敲低miR-218-5p对GTSE1蛋白表达水平的影响。图4 miR-218-5p能够靶向下调GTSE1的表达

A:通过qRT-PCR和Western blot检测转染后PC-9和A549细胞系中GTSE1的mRNA和蛋白表达水平;B:CCK8检测肺腺癌细胞系PC-9和A549中各转染组的细胞活力;C:克隆形成实验检测肺腺癌细胞系PC-9和A549中各转染组的细胞克隆形成能力;D、E:Transwell用来评估肺腺癌细胞系PC-9和A549中各转染组的细胞迁移与侵袭能力(×100);与mimic NC+oe-NC组比较,*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001;与mimic NC+oe-GTSE1组比较,#:P<0.05;##:P<0.01;###:P<0.001。图5 miR-218-5p通过下调GTSE1抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭

3 讨论

研究显示,GTSE1在多种肿瘤组织和细胞中高表达,抑制肿瘤细胞凋亡［4],但是GTSE1在肺腺癌进程中的研究鲜有报道。本研究通过从TCGA数据库中下载肺腺癌的mRNA的表达量数据和临床数据,通过差异分析和生存分析确定靶基因GTSE1为研究对象。通过qRT-PCR和Western blot证实GTSE1在肺腺癌细胞系中高表达,这与其他研究人员在肝癌［10]、乳腺癌［5]、膀胱癌［11]等肿瘤中的研究结果一致。通过检测GTSE1对肺腺癌细胞功能变化的影响,发现过表达GTSE1后,肺腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力得到了显著增强。因此,我们认为GTSE1在肺腺癌的恶性进程中可能作为一个促癌因子发挥重要作用。

接着,为了进一步探究GTSE1在肺腺癌中的分子调控机制,我们对其上游调控基因进行挖掘。通过starBase数据库预测GTSE1的上游调控基因,发现miR-218-5p在肺腺癌组织中低表达,与GTSE1相关性最高,并通过生信靶向结合位点预测及双荧光素酶报告基因实验加以验证两者的结合关系。miR-218-5p在多种肿瘤组织中呈现低表达,并影响癌症的进程［12-15]。例如,Yang等［13]的研究表明,miR-218-5p通过靶向SHMT1抑制NK细胞对LA细胞的杀伤作用,并通过改善NK细胞的功能为LA治疗提供了潜在的靶点。Yang等［14]通过实验得到miR-218的过表达在体外可降低细胞增殖、侵袭,集落形成和肿瘤球形成,并且miR-218宿主基因的水平和IL-6/STAT3途径的成分均与肺癌患者的预后相关。在本实验中,我们的研究结果证明了miR-218-5p在肺腺癌细胞和组织中下调表达,并且过表达miR-218-5p能够抑制肺腺癌的恶性进展,但这种抑制作用能够被GTSE1过表达处理所恢复。这进一步揭示了miR-218-5p在肺腺癌发生发展进程中很可能作为一个抑癌因子。

综上所述,本研究证实了GTSE1在肺腺癌组织和细胞中显著上调,且GTSE1的表达与患者预后具有相关性,并发现了miR-218-5p是GTSE1 的上游调控基因,低表达的miR-218-5p参与了肺腺癌的发生发展过程。基于本研究有助于了解miR-218-5p/GTSE1调控轴在肿瘤发生进程中的生物学功能,对miR-218-5p/GTSE1检测在肺腺癌患者的早期诊断及预后判断中具有一定的参考价值,有望为肺腺癌的临床治疗提供新的理论依据。