6 个香菇L135 菌株主要性状的比较分析

刘 昆 蒋 俊 宋小亚 路新彦 曾凡清 应国华

（丽水市农林科学研究院 浙江 丽水 323000）

香菇（Lentinulaedodes）具有重要的食用和药用价值，在中国已经有800 余年的栽培历史[1-2]。据中国食用菌协会统计，2021 年我国香菇鲜品总产量近1 300 万吨，占所有食用菌总产量的31.34%，是我国第一大菇种[3]。随着栽培规模与菌种使用年数的增加，主栽品种在历经数次传代、分离、保藏、繁育和运输后，出现了菌种退化现象，给香菇产业健康发展带来不良影响。

香菇品种L135（国品认菌2007005）为福建省三明市真菌研究所于2007 年筛选育成。为低温晚熟型品种，菌龄160～200 天，子实体柄短肉厚，菇形圆正，鳞片少，易形成花菇。其菌丝抗逆性较差，抗杂菌能力较弱，不耐高温，不易越夏，适宜32 ℃以下区域或海拔较高、气温凉爽地区栽培。浙江省庆元县、景宁县等高海拔山区因夏季凉爽、冬季温差大，满足L135 品种特性要求，因而L135曾被菇农广泛栽培。近年来，L135 品种在生产中逐渐表现出烂棒率高，产量低，菇小、畸形等问题，给菇农带来了严重的经济损失[4]。

为研究香菇L135 品种退化的原因，探索香菇品种退化的内在机理，本文以6 个不同来源的生产用L135 菌株为实验材料，对其菌丝形态、漆酶活性、抗高温能力、栽培产量、子实体特征等进行比较分析，期望筛选出遗传稳定、性状较好与明显退化的菌株，为进一步研究香菇种性退化机理奠定基础，为香菇品种选育提供指导。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

从丽水各地收集不同来源且栽培中使用的香菇L135 品种菌株，经初步筛选后获得6 株表型差异明显的菌株，编号分别为：L135-1、L135-18、L135-19、L135-21、L135-29、L135-30。为了确定菌株的真实性，以上海农业科学院食用菌研究所提供的L135 菌株为对照，按照国家农业标准NYT 1845—2010《食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应》、NY/T 1743—2009《食用菌菌种真实性鉴定 RAPD法》、NY/T 1730—2009《食用菌菌种真实性鉴定ISSR 法》，对6 个菌株进行了真实性鉴定，鉴定结果显示所有菌株均真实可靠。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基制作

马铃薯葡萄糖琼脂粉（PDA）培养基：购自荣研生物科技（中国）有限公司，按照说明书加热溶解，于121 ℃灭菌20 min，待温度降至60 ℃左右时，分装于直径90 mm 培养皿中，每皿20 mL。

木屑培养基：培养基配方为杂木屑78%、麦麸20%、红糖1%、石膏1%，料水比为1∶1.2，pH自然。取木屑培养基45 g 分装于20 mm×300 mm试管中，使用木棒压平至固定高度，硅胶塞封口，121 ℃灭菌60 min，冷却至常温后备用。

木屑琼脂培养基：培养基配方为杂木屑（粉碎机粉碎2 min，10 目过筛）78 g、麦麸20 g、石膏1 g、葡萄糖1 g、琼脂粉16 g，混合搅拌均匀后，称取2.90 g 分装到100 mL 三角瓶，加水25 mL，于121 ℃灭菌30 min，待温度降至60 ℃左右时，分装于直径90 mm 培养皿中，每皿20 mL。

愈创木酚（POD）培养基：PDA 培养基中加入0.04%愈创木酚，于121 ℃灭菌20 min 灭菌后分装于90 mm 培养皿中，每皿20 mL[5]。

漆酶活性定量试剂盒：购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2.2 菌株活化

将试验菌株从试管斜面中接种于PDA 平板中心，于25 ℃下活化培养7 天，使用7 mm 打孔器，在菌落边缘同步生长菌丝处取菌丝块，用于后续试验。

1.2.3 菌株性状检测

菌丝形态观察。将活化菌丝块分别接种于PDA平板与木屑琼脂培养基中心，每个菌株3 个重复，于25 ℃培养30 天，观察菌丝形态生长变化情况。

菌丝生长速度测定。将3 块活化菌丝块接种于装有木屑培养基的试管中心，于25 ℃温度下直立培养，待菌丝生长1 cm 时，划起始生长线，最快菌株菌丝生长至距试管底部1 cm 时划终止生长线，测量生长距离，计算日均生长速度。

漆酶活性定性测定。将活化菌丝块接种于POD平板上，每个菌株3 个重复，25 ℃培养8～12 天，每天定时记录有无红棕色变色圈的产生及变色圈直径的大小，记录变色圈直径。根据变色圈的直径大小，检测漆酶产生能力。

漆酶活性定量测定。将活化菌丝块分别接种于铺有半透膜的木屑培养基平板上，每个菌株3 个重复，25 ℃培养15 天，收集菌丝体。于液氮中将菌丝体研磨成粉末状。按照漆酶活性检测试盒说明书进行漆酶定量测试。

高温协迫检测。将3 块活化菌丝块接种于装有木屑培养基的大试管中，25 ℃培养7～10 天后，划起始生长线。随后置于42 ℃高温处理4 h 后，继续25 ℃培养，菌丝距试管底部1 cm 时，划终止生长线，测量生长距离，计算高温胁迫处理后菌丝生长速度。

农艺性状检测。栽培地点位于浙江省丽水市景宁县包凤村，在高棚内采用常规层架式栽培出菇管理。栽培料配方为杂木屑79%，麦麸20%，石膏1%，含水量55%～60%，pH 自然。栽培袋规格为15 cm×55 cm，每袋填装栽培料1.8 kg，常压灭菌，开放式接种。每个菌株设3 个小区重复，每重复36 棒。子实体菌幕裂开但未完全消失时进行采摘，统计单棒产量。每个菌株随机挑取100 个子实体，测量子实体单菇重，菌盖直径、厚度，以及菌柄直径和长度。

1.2.4 数据分析

使用R 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 香菇L135 不同菌株菌丝形态

分别接种到PDA 培养基和木屑琼脂培养基的6 个L135 菌株菌丝形态差异明显（图1）。在PDA培养基中，菌株L135-1、L135-18、L135-19 菌丝较稀疏，无加厚隆起，无原基形成。在木屑琼脂培养基中，菌株L135-1 菌丝明显稀疏，L135-18、L135-19 菌丝相对较浓，但无褐色斑点、子实体原基发生。菌株L135-21、L135-29、L135-30 在两种培养基均出现菌丝局部加厚隆起、变色及出现子实体原基形态等现象，与大田栽培中正常菌棒转色前期菌丝隆起现象类似。

图1 香菇L135 不同菌株在PDA 培养基（上）和木屑琼脂培养基（下）的菌丝形态

2.2 香菇L135 不同菌株菌丝生长速度

如表1 所示，在木屑培养基中，6 个菌株菌丝生长速度差异明显，其中以L135-29、L135-30 较快，分别为7.31 mm/d和7.24 mm/d；L135-21次之；L135-1、L138-18、L135-19 均低于7.0 mm/d，L135-1最慢，仅5.17 mm/d，显著低于其他菌株。

表1 香菇L135 不同菌株菌丝生长速度

2.3 香菇L135 不同菌株菌丝漆酶活性定性分析

L135 菌株漆酶活性测定结果表明（表2、图2），不同菌株之间差异明显。L135-1 菌株在POD 平板上的菌丝呈絮状，氧化圈颜色较浅；L135-18、L135-19 菌株在POD 平板中的菌丝致密，氧化圈颜色最深；L135-21、L135-29、L135-30 菌株在POD平板中菌丝量居中，氧化圈颜色较浅。综合得出6个菌株漆酶活性从高到低依次为：L135-21、L135-30、L135-29、L135-1、L135-18、L135-19。

表2 香菇L135 不同菌株的漆酶活性

图2 香菇L135 不同菌株在POD 平板培养基上的生长表现

2.4 香菇L135 不同菌株菌丝漆酶活性定量分析

漆酶活性定量分析结果（表2）表明，6 个菌株之间差异明显，不同菌株之间的漆酶活性变化趋势与定性测试结果相近。菌株L135-30、L135-21、L135-29 漆酶活性仍较高，其余3 个菌株漆酶活性表现较差，其中L135-1 菌株漆酶活性仅为31.37 U/g，远低于其他菌株。

2.5 香菇L135 不同菌株抗高温能力

6 个L135 菌株经42 ℃处理4 个小时后，菌丝长势与生长速度出现明显的差异（表3、图3）。在菌丝长势方面，以菌株L135-21 菌丝表现浓密、洁白，其他5 个菌株呈现出不同程度的菌丝淡化现象。在生长速度方面，菌株L135-21、L135-29、L135-30 较快，3 个菌株间无显著差异，L135-18、L135-19 菌株次之，L135-1 最慢。表明抗高温能力菌株L135-21 较强，其余菌株偏弱。

表3 香菇L135 不同菌株高温胁迫后生长速度

图3 香菇L135 不同菌株高温胁迫后菌丝生长情况

2.6 香菇L135 不同菌株子实体形态

在子实体形态方面（表4），菌株L135-29 的单菇重、菌盖直径和厚度、菌柄长度和直径均显著优于其他菌株，但其有36%的子实体菌盖中心会向上明显伸长，呈典型的尖顶形状，商品性状反而较差；L135-21 单菇重等5 个指标居次，而子实体尖顶率较低，仅0.94%；L135-1、L135-30 子实体整体均偏小，表现较差。L135-18、L135-19 在越夏过程中菌棒烂棒严重，子实体数量较少，未能进行有效统计分析。

表4 香菇L135 不同菌株子实体形态特征数据

2.7 香菇L135 不同菌株栽培产量

如表5 所示，6 个菌株的子实体产量差异显著。L135-1、L135-21、L135-29 每棒平均产量均超过280 g，明显高于另外3 个菌株，3 菌株之间产量差异不显著。菌棒转色速度，L135-1 明显慢于其他菌株，且出菇集中于前两潮，子实体较小，商品价值不高。菌株L135-18、L135-19、L135-30 产量极低，不适合栽培生产。

表5 香菇L135 不同菌株栽培产量

3 结论与讨论

同一品种不同菌株间遗传背景相近，从中筛选出性状优良与疑退化菌株，更容易以彼此为参照，探索香菇品种退化的内在机理。本研究以丽水当地生产中曾广泛栽培的L135 品种为试验对象，共收集30 余份不同来源的菌株，经前期栽培筛选，初步获得6 株表型差异较显著的菌株。为了验证这些菌株的遗传稳定性与性状差异，为后续研究奠定材料基础，本文对L135 品种6 个不同表型菌株的菌丝形态、菌丝生长速度、产漆酶能力、抗高温能力、子实体形态、栽培产量等方面进行分析。

菌株L135-1 在菌丝形态、漆酶活性、抗高温能力等方面均表现较差，但栽培产量较高，与L135-21、L135-29 无显著差异，且出菇期集中在前2 潮，但子实体较小，栽培效益不高。L135-30 耐高温能力、产漆酶能力虽然较高，但产量与子实体形态均较差。L135-18 与L135-19 在各个方面均表现较差，且在越夏过程中菌棒烂棒严重，产量极低。综合以上结果，L135-1、L135-18、L135-19、L135-30共4 个菌株初步判定为退化明显株系，并且可能代表着3 个不同的退化类型，可作为后续退化机理研究的代表菌株。

菌株L135-21 的菌丝体形态正常、漆酶活性高，抗高温、产量高、子实形态较好，性状良好，可作为后续分析的正常对照菌株。相比 L135-21，L135-29 各性状也较好，但其尖顶子实体占比较高，商品价值低，菌株整体性状一般。

在前期预实验中发现，6 个L135 菌株在PDA培养基中的生长速度、耐高温能力与菌丝体形态、子实体形态、栽培产量等并没有较好的对应关系。为了获得各性状可相互对应的数据，本研究中菌丝体形态、菌丝生长速度、高温胁迫等实验均使用了与栽培相近的木屑培养基，结果发现木屑培养基优于PDA 培养基，更适合不同菌株之间的相互比较。但木屑琼脂培养基因颜色较深，对漆酶活性的定性测试有影响，未能在相应实验中使用。

香菇属于白色木腐菌，在栽培过程对木屑中的木质素、纤维素、半纤维素具有明显的降解作用[6]。漆酶是分解木质素的重要酶，对其进行检测可反映香菇菌丝对栽培基质的利用能力。除了降解木质素作用外，漆酶在色素合成、子实体形成、脱毒等方面都扮演了重要的角色[7]。漆酶对香菇生长有着重要作用，本研究中部分菌株的菌丝产漆酶能力与菌丝形态、栽培产量、子实体形态、抗高温能力等指标也有一定的相关性。但香菇菌丝中的其他氧化酶可能也会对愈创木酚进行氧化[7]，造成定性测试与定量测试有一定的误差，后续还需要对漆酶定性试验进行改进，提升其准确性。