基于细胞特性的代谢反应工程技术创新及产业应用

柳 东，王振宇，陈 勇，庄 伟，朱晨杰，应汉杰

(南京工业大学生物与制药工程学院国家生化工程技术研究中心，江苏 南京 211800)

细胞代谢反应工程是生物制造的核心，在成百上千个酶组成的代谢反应途径网络中，细胞代谢反应的方向和速率决定产品的生产效率，影响产品的质量和成本[1]。细胞代谢反应受胞外环境和细胞内在特性的调控，过去人们主要关注细胞与环境间的关系，依赖生化反应过程的宏观参数和经验模型来进行代谢反应过程优化，是一种黑箱优化过程[2]，使得细胞潜能难以充分发挥，生产效率较低。

在细胞代谢反应工程领域，本团队很早就在欧阳平凯老师的指导下开展相关研究。1987年，欧阳老师在国外完成生物技术进修，回国后开创了全国第一个生物化工专业，成为我国最早开拓生物化工领域的学科带头人。同时，他提出“工程中提炼科学问题，基础研究解决关键技术”的研究思想。为此，本团队在关注胞外工程环境的同时，围绕细胞内在特性来凝练代谢反应工程的核心问题和共性关键技术，基于细胞的代谢与遗传特性开发能量调控、细胞时空调控和细胞集群调控等系列调控细胞代谢反应的普适性技术，实现了工程应用突破，显著提升了1,6-二磷酸果糖(FDP)、酵母核苷酸和虫草素等面向生命健康的医药、营养等化学品的产品得率和生产效率；同时，创建了工业规模的基于细胞集群效应的新型连续发酵技术，推动燃料乙醇、氨基酸等更多产品的生物制造过程从间歇式向连续化转变。

本文综述基于细胞特性的代谢反应工程技术及其应用进展，同时分析该领域代表性产品的生产水平，并展望今后的发展前景。

1 基于能量调控的代谢反应工程技术

细胞物质代谢与能量代谢在代谢反应网络中是相互耦合的，可依据细胞物质与能量代谢的基础特性，建立利用能量辅因子调控物质代谢的反应工程技术，能够广泛应用于FDP、核苷酸等能量密集型物质的合成。FDP是一种激活细胞能量代谢的高能化合物，它可以在细胞缺氧的时候通过刺激无氧代谢来为细胞提供能量，避免组织器官损伤和死亡，是休克、心肌梗死等急性缺氧病人的首选药物之一。然而，作为糖酵解过程的中间代谢产物，FDP能量极高且极易被降解，因此在代谢过程中FDP高浓度积累成为技术瓶颈。在20世纪80年代初，我国FDP生物制造水平很低，无法与垄断全球市场的意大利生化制药公司Biomedica Foscama的生产技术相竞争[3-4]。因此，我国需要大量进口该公司生产的药品依福那(Esafosfina)，20世纪90年代的进口额曾位列全国药品第6位、心脑血管药物第1位。以当时价格来算，普通人的一个月工资只能买一支药，所以依福那被称为“贵族药”。

我国政府对此高度重视，在欧阳平凯老师的带领下，组织了生物法制造FDP的国家“八五”科技攻关重点项目。在那个文献资源匮乏的年代，欧阳老师极力帮助检索国内外相关文献，并直接带领处于研究一线的博士生应汉杰进行技术攻关，经试验研究发现，碳物质代谢途径和能量ATP代谢途径中代谢流量和代谢速率的不匹配是底物葡萄糖和无机磷酸盐难以高效转化到目标产物FDP最主要的原因，这是因为ATP既是能量物质又是反应底物，FDP的合成需要大量ATP的供应，但与此同时，ATP与关键酶结合后又会抑制ATP的产生与FDP合成反应，最终导致无法产生大量能量来合成FDP。因此，ATP在这个过程中表现出“半推半阻”的作用，这体现了细胞天然具有代谢自平衡的基本特性，一般情况下难以在常态下打破此平衡。与此同时，国外Gregory Stephanopoulos等[5-6]刚提出“代谢工程”概念不久，欧阳老师意识到此技术的重要性，借鉴此技术来研究FDP的生物合成，并首次从能量ATP的需求以及ATP对糖酵解关键酶的变构调节效应的角度，建立了FDP累积的代谢途径流量模型，阐明了FDP累积机制并通过提高能量ATP再生和能量自偶联效率的方法，最终实现了FDP的高效生产(图1)，使得FDP在代谢途径中的产量从最开始的国内研究的一般水平0.3 g/L，逐步上升到26 g/L，并最终提高到76 g/L，反超Biomedica Foscama公司的技术，对底物的转化率比该公司的转化率提高了130%[7-8]。

在通过能量调控实现FDP的高效生产之后，团队面向产品化应用需求又解决了FDP的结晶问题。FDP是一种高亲水性化合物，结晶非常困难。同时，FDF在结晶时黏度高，成核难，生长慢，易形成无定形沉淀而影响产品纯度和药用品质。欧阳老师带领团队在请教行业专家的基础上，基于FDP的特性发明了独特的醇析和盐析复合结晶新技术，并开发了结晶装备，解决了FDP结晶难以及晶体缺陷夹带母液杂质、产品刺激性大的问题，得到高纯的FDP产品，并以此生产出全球唯一无疼痛感的FDP针剂，产品质量明显优于市场上的同类产品[9]，最终将FDP的全链生产技术在海南长安和南京圣诺等单位进行产业转化，使国内市场FDP产品的售价大幅度降低。这不但打破了Biomedica Foscama公司多年的垄断，还带动了国内 FDP产品销量的增长，使“贵族药”进入了寻常百姓家[10]，为国民的健康提供坚实的物质基础。

同时，基于FDP生产技术所开发的能量调控方法广泛应用于谷胱甘肽、虫草素、燕窝酸、核苷酸、环磷腺苷以及胞苷二磷酰胆碱等产品的高效生物制造[11]，成为制备需要大量生物能量物质的平台技术。

2 基于细胞生长周期的时空调控技术

因为细胞的基因表达以及核酸、蛋白质和多糖等生物大分子的合成与积累浓度具有时空特异性，所以可依据细胞基因的时空表达与调控特性，开发细胞高效培养的时空调控技术，这能够广泛应用于核酸和蛋白质等内源性生理活性物质的高效生产。核糖核酸(RNA)是生物遗传信息的载体，而核苷酸是RNA的基本组成单元，同时研究发现，核苷酸是母乳中的重要生物活性分子，不仅与婴幼儿的发育和成长相关，而且也是重要的医药中间体和mRNA疫苗的前体原料。但是，生物制造核苷酸的工艺流程复杂、技术难度大。由于我国生物制造核苷酸的产业不够强大，原料RNA、水解RNA的核酸酶以及生产核苷酸的核心技术分别被意大利Prosol公司、日本Amano公司以及Yamasa公司这3家公司所掌控[12]，当时我国一直没有研发出能与国外抗衡的生产技术。

在酵母细胞体内，合成RNA的途径不但复杂，而且胞内的含量也较低，正常酵母细胞核酸含量仅为6%～8%，最高水平为12%～14%[13-14]。笔者所在团队在系统研究RNA等生物大分子在酵母中累积变化的机制后发现，细胞内的遗传物质(如DNA、RNA和蛋白质等)的合成与分解，与细胞自身的不同发育阶段密切相关，不同生长期的细胞内的遗传物质含量也不同，即细胞内的遗传物质存在自动调整的特性(图2)，基于此，团队提出了双重调控RNA累积的新思路，经系统研究，发明了基于细胞对数生长期的时空调控新技术，同时设计了与之配套的新型生物反应器，实现了酵母细胞的连续化、快速高效培养以及RNA的高浓度生产[15]，最终酵母中RNA含量提高到18%～20%，时空效率提高了230%。

图2 酵母RNA合成与分解过程示意Fig.2 Schematic illustration of RNA biosynthesis and degradation in yeast

在实现RNA原料的高效制造后，团队还通过诱变育种和连续驯化选育出高效水解RNA的酶，与日本公司相比具有更高的酶活和稳定性[16-17]。然而，水解RNA来制备4种分子量、分子结构和理化特性相近的核苷酸单体，存在水解反应副产物多、分离流程长、工艺复杂和产品收率低等问题，这不仅是完整的生物法制造核苷酸所面临的问题，也是很多生物加工过程必须解决的实际问题，即产物分离流程复杂、单元设备多且效率低。欧阳老师基于化学工程和生物技术学科交叉的理念，创造性地提出了运用组合合成的方法构建与优化生物化工过程，使我国多种生物化工产品的生产技术达到了国际先进水平，也获得我国生物化工领域首个国家科技进步一等奖(2000年)。之后，欧阳老师提出，以流程重构的思路来解决水解RNA法制备核苷酸存在的问题。在欧阳老师的启发和指导下，团队探索以过程耦合、过程模拟为核心的生物化工过程集成新方法，研究生物特性与工业环境之间的适配关系，建立了生物反应-分离耦合和反应-反应耦合等流程重构技术，构建了绿色高效的核苷酸分离新工艺，使核心分离流程、工艺流程和装备大大简化，产品收率和质量明显优于国内外同行[18-19]。最终，团队建成了国际上规模最大的、技术最先进的第一条从酵母—核酸—核苷酸的生物制造生产线，迫使日本Yamasa等公司退出国内市场[20]。先进的核苷酸生物制造技术有力支撑国内婴幼儿奶粉企业往母乳化发展，同时产品大量出口到美国最好的乳品企业雅培、世界最大的乳品企业新西兰恒天然、世界最大食品制造商瑞士雀巢、生物医药巨头企业罗氏等众多世界500强公司。目前，全球每10罐添加核苷酸的高端婴儿配奶粉中就有4罐由本技术生产的产品[21]。核苷酸生产成本的大幅下降，推动了核苷酸在饲料、农业等领域的应用，可在促进幼体发育、改善肉质及血浆蛋白替代等方面发挥重要的作用，为我国养殖业的低抗和无抗饲养计划做出贡献。

3 基于细胞集群效应的连续发酵技术

发酵工业经历了几千年以作坊式固态培养为主体的发展后，最终于20世纪40年代借鉴化学反应工程的概念和方法建立了深层液态培养的现代发酵技术，这有利于克服固态培养存在的传质和传热差、发酵参数难以定量化检测以及自动化程度低等问题，实现了众多化学品生产效率大幅度提升[22-23]。然而，现行的深层液态发酵是以游离细胞为主的间歇式发酵，由于存在细胞易衰亡、无法持续使用等问题，发酵过程不能像化工催化过程那样实现连续化、高效化，因此需要反复进行育种、接种、洗罐和灭菌等工序[24-25]，这不仅使生物催化过程时空效率低、原子经济性差，而且存在生产能耗较高、碳排放大的问题。虽然细胞包埋、共价交联和膜截留等技术被开发出来以解决此问题，但因这些技术存在介质生物相容性差、细胞无法稳定增殖和修复等问题，最终难以在工业规模上实现高效的应用。

如何才能充分发挥细胞的应用潜能？在自然界中，微生物大都以固定而非浮游的方式吸附于各类固体表面，即使是海洋微生物似乎也不喜欢在海水里“游泳”，目前已分离的98%以上的海洋微生物均附着于海洋中的固形物表面[26]。在合适的固形物表面，微生物规模化集聚即可产生群体效应，以提高其整体的生存能力[27]。如肠道微生物，通过与肠道绒毛、褶皱等表面互作而定植，因此在遭受抗生素用药、流食冲击后能够很快恢复自我增殖和生长，具有很强的环境抗逆、抗冲击和自修复能力。在自然界中的很多现象表明，个体在群聚后会突显一些新的效应。如，蝗虫，单个蝗虫不足为患，但在大规模群聚后，其形态、色泽、攻击力和代谢会发生大幅改变，对农作物产生巨大的破坏力，造成严重的经济损失。

为此，借鉴个体蝗虫形成高密度蝗虫群后其体态和行为发生巨大变化的启示，模仿肠道菌群黏附的原理，团队从基因、环境和信号等方面探究并构建细胞集群的分子基础，实现了细胞的快速定植和高密度集聚[28-30]，同时提出了死活细胞原位更替的思路，创建了持久稳定的细胞集群反应新体系[31-32]，最终开发出基于细胞集群效应的连续发酵技术。此技术也是在欧阳老师指导下完成的，同时，欧阳老师认为，该技术是“新型节能高效发酵技术，大幅降低生产成本，市场规模和利润空间巨大”。欧阳老师还特别强调，细胞集群效应值得好好研究。在将此技术应用于多种不同的工业发酵体系后发现，微生物细胞在高密度定植后，耐受性、寿命和活力大幅提高，因此细胞的反应性能提升、用量大幅减少，这使得合成细胞的物质和能量向合成目标产物的反应转移，从而提高了碳源利用的原子经济性。同时，该技术的核心发酵工段可连续化运行，能革除育种、扩培、接种、洗罐和灭菌等配套工序和工段，从而明显降低过程运行的物耗和能耗，提高了时空生产效率(图3)。

图3 基于细胞集群效应的连续发酵工序简化Fig.3 Simplified and continuous fermentation process based on cell clustering reaction system

2019年该技术与广西中粮生物质能源有限公司合作应用于燃料乙醇的生产，首次实现了燃料乙醇从间歇式向连续化大规模生产的转变，得率提高4～6个百分点，整体效率提高了42%，打破了近年来燃料乙醇每提高一个百分点都极其困难的局面，被鉴定为是“近二十年来该领域最具创新性的生产技术之一”[33-34]。2021—2022年，在宿州中粮生物化学有限公司连续化示范运行近2年。2023年与中国石油天然气集团有限公司合作，成功在其单台套3 400 m3世界最大的生物反应器上进行应用[35]。该技术成为提升生物发酵过程生产效率的重大工程科技创新，受到多家发酵巨头企业青睐，正在氨基酸、有机酸生产等领域进行推广应用，有望推动生物医药与健康、能源与环境、农业与食品等更多产品的生物制造从间歇式走向连续化。

在技术取得了阶段性成功后，欧阳老师又提出了新的期望，他曾召开专门会议，建议通过整合在反应器制造、发酵工程、生物分离和制药等学科方面的优势，未来可筹划基于细胞集群效应的生物医药CDMO平台，为解决我国大分子生物药生产行业硬件和耗材等卡脖子问题提供技术支撑。可见，基于细胞集聚的特性，可创建具有自增殖、自修复功能的细胞集群反应体系，推动众多产品的工业生物发酵过程从间歇式向连续化转变，有望发展成为一项对传统发酵过程有颠覆性变革的平台技术。

4 结论与展望

细胞代谢反应工程技术包括细胞的改造技术和应用技术两方面。近年来，以合成生物学为代表的细胞改造技术备受关注，国内外均开展大量研究，使得细胞创制和改造效率大幅提高。相比之下，规模化发酵生产技术尚未有变革性突破，日益成为限制菌株潜能释放及产品商业化可行的关键。尤其对于大宗化学品而言，很多菌种改良水平已接近“天花板”，如燃料乙醇近六十年来对原料的得率只提高了约一个百分点，其生产水平突破将更加依赖于细胞的应用过程。

细胞的规模化工程应用是一个集生物学、机械、化工、物理及材料等领域知识于一体的高度复杂化、系统化的科学，细胞应用技术的颠覆性创新需要分子层面的生物科学与工程基础相结合。基于细胞特性的代谢反应工程技术创新，是发挥细胞应用潜能、催生变革性生产方式的有力手段。未来，合成生物学调控技术与细胞生理学工程相结合，可实现更多生物工程技术的原始创新，更有利于在工业生产体系下牵制细胞特性这一“牛鼻子”，创制更多的变革性生产技术和模式，从而提高新一代生物制造过程的原子经济性和时空生产效率。