深绿木霉TraT2A对5种作物的促生作用研究

张国印,梁巧兰,魏列新

(甘肃农业大学植物保护学院,甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室,甘肃 兰州 730070)

木霉菌(Trichoderma)是一类重要的植物病害生防菌,根据GAMS和BISSETT分类系统,其属于半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(Hyphomycetales)、粘孢菌(Gloiosporae)类[1-2],普遍存在并广泛分布于植物根际土壤、腐烂植被和其他基质中[3]。木霉菌具有多种生防机制,包括竞争作用、重寄生作用、抗生作用、诱导抗病作用[4];此外,木霉菌含部分促进植物生长的基因,定殖在植物根际时,能够改善土壤微生态环境、影响植物激素的合成与运输、降低土壤pH值和提高养分利用率,因此木霉菌可以促进植物生长[4-7]。据报道,哈茨木霉(Trichodermaharzianum)处理过的黄瓜和砂糖橘与对照相比,根长和叶绿素b含量均显著增加[8-9]。鲁海菊等[10]研究表明,把内生木霉菌(EndophyticTrichoderma) P3.9菌株接种于枇杷主干韧皮部第30天,处理组的叶绿素质量分数比对照大0.01 mg·g-1,株高每株比对照大5 mm。王禹佳等发现[11],绿色木霉(Trichodermavirid)处理后茎粗和叶绿素含量分别提高了42.8%和60.6%,相比对照差异显著。Rao等[12]发现T.atrovirideLZ42处理后,番茄幼苗地上部分和根的干质量明显增加,并且其释放的挥发性有机化合物VOCs影响番茄幼苗主根的生长方向,促进番茄幼苗主根的生长。深绿木霉(T.atroviride) T1处理后的番茄根长、鲜质量和干质量相比对照分别提高了34.91%、30.27%和15.04%[13];深绿木霉(T.atroviride) D16菌肥(15 g)与丹参苗共培养后,在盆栽和大田环境下干质量分别是同期对照组的5.61倍和1.42倍[14];106个·mL-1的深绿木霉(T.atroviride) H18-1-1孢子悬浮液处理小白菜后,可使其鲜质量增加88%[15];深绿木霉(T.atroviride) HB20111对西洋参的种子包衣处理后,其第一年的出苗率为87%,明显高于对照组56.5%[16]。

TraT2A作为深绿木霉(T.atroviride)T2菌株发酵液的蛋白提取物[17],高浓度对百合灰霉病菌(Botrytiscinereal)和百合叶斑病菌(Alternariaalternate)具有较高的抑制作用,抑制率分别为47.44%和72.12%,低浓度对百合灰霉病菌(B.cinerea)具有较高的诱导抗病作用,诱导效果可达55.89%[18-21];而且,200倍液TraT2A处理百合鳞片后有明显的促生效果,发芽率和每鳞片发芽数分别为100%、5.85个[22]。但是,TraT2A对其他作物的促生作用研究尚未进行。为此,本试验以TraT2A蛋白为研究对象,测定了TraT2A蛋白处理后对小麦、玉米、豇豆、辣椒和黄瓜5种作物种子的发芽率、幼苗生长、叶绿素含量等生理指标的影响,旨在明确其对以上5种作物生长的促生作用。研究结果可为TraT2A生物菌肥的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试药剂:深绿木霉T2菌株发酵液蛋白提取物(TraT2A)由甘肃农业大学植物保护学院农药学实验室发酵提取(TraT2A在595 nm处的OD值为3.26,产量为200 mL·L-1)[20];80%丙酮、石英砂、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、1%TTC溶液、磷酸缓冲液、1 mol·L-1硫酸、0.4 mol·L-1琥珀酸钠、0.6%硫代巴比妥酸、10%三氯乙酸,均为分析纯。

供试作物种子:小麦(黑龙江丰鸿种业有限公司)、玉米(山东寿光创迹农业有限公司)、豇豆(河北庆沣种业有限公司)、辣椒(河北庆沣种业有限公司)和黄瓜(河北庆沣种业有限公司)。

仪器设备:电子天平AR224CN(上海奥豪斯仪器有限公司)、紫外可见分光光度计UV-9000S(上海元析仪器有限公司)、高速冷冻离心机5430R(德国Eppendorf艾本德有限公司)、LED顶置人工气候箱QRDN-1500T-4(杭州琦胜电子科技有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱HGZF-11/H-101-3(上海跃进医疗器械有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 深绿木霉TraT2A蛋白对5种作物种子萌发的影响 选取大小一致、成熟饱满的小麦、玉米、豇豆、辣椒和黄瓜种子,于70%酒精中消毒1 min,5%NaClO溶液消毒5 min,无菌水冲洗3次后,对照组用无菌水浸泡8 h,处理组无菌水浸泡3 h后再用不同浓度TraT2A浸泡5 h。用灭菌滤纸吸取多余液体后,放置于灭菌培养皿中(培养皿底部垫有海绵,上覆1层灭菌滤纸)保湿催芽,每皿20粒。处理组分别加入100.00 mg·mL-1、20.00 mg·mL-1、10.00 mg·mL-1和2.00 mg·mL-1的TraT2A,对照组(CK)加入无菌水,每皿10 mL,每个处理重复3次。置于温度25℃、相对湿度60%、暗/光交替(16 h/8 h)恒温培养箱中培养,采用称重法每日补充等量的TraT2A和无菌水,3 d后统计种子发芽数,计算发芽率、发芽指数,然后将各发芽种子装入称量瓶中,放置于烘箱中,在105℃下处理30 min后,将温度调至80℃烘干,再用电子天平称量[23],计算活力指数。

式中,Gt为t时间内的发芽数,Dt为相应的发芽天数。

活力指数=发芽指数×单株平均干质量

1.2.2 深绿木霉TraT2A蛋白对5种作物幼苗形态指标的影响 按1.2.1小节方法处理5种作物种子,每个培养皿20粒,3次重复,培养7 d后,用刻度尺测量胚根和胚轴,然后用滤纸吸干植株表面水分,立即用电子天平称量其质量,即鲜质量,然后按1.2.1小节方法测定干质量,最后计算促生率。

1.2.3 深绿木霉TraT2A蛋白对5种作物幼苗生理指标的影响 根据发芽期到幼苗期形态指标的测定数据,选取TraT2A对5种作物促生效果最好的浓度进行生理生化测定。每种作物挑选30粒种子,设3组重复。先对作物种子进行催芽处理,方法同1.2.1小节,处理组加入10.00 mL的TraT2A蛋白,对照组加入10.00 mL无菌水。3 d后移栽到装灭菌土的花盆中,花盆直径28 cm,高25 cm,每盆种10株幼苗。采用称重法每日补充等量的TraT2A和灭菌水,在14 d时进行部分生理生化指标测定(叶绿素含量、根系活力和丙二醛含量)。

幼苗叶绿素含量测定采用分光光度法[24],根系活力采用TTC法(氯化三苯基四氮唑法)测定[25-26],丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定[27],最后计算促生率。

1.2.4 数据分析 利用Excel 2010进行数据处理并采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析,各处理的差异显著性检验采用Duncan新复极差法。

2 结果与分析

2.1 深绿木霉发酵液蛋白提取物TraT2A对5种作物种子萌发的影响

由表1可知,4种不同浓度TraT2A处理5种作物种子后,与对照相比发芽率、发芽指数和活力指数均有显著提高(P<0.05),且对不同作物的促生效果不同。其中10 mg·mL-1TraT2A处理的5种作物的发芽率、发芽指数和活力指数均为最高,黄瓜的发芽率最高为93.66%,小麦的发芽指数最高为15.16,玉米的活力指数最大为12.55,与对照发芽率(80.00%)、发芽指数(13.58)和活力指数(7.37)相比,分别提高了16.64%、11.63%和70.31%(图1)。100 mg·mL-1TraT2A处理后的促生率最低(表1),其中玉米的发芽率最低,为80.67%;豇豆的发芽指数最低,为10.01,辣椒的活力指数最低,为3.57,但均高于对照。其他浓度处理的作物的发芽率、发芽指数和活力指数数值均介于上述处理浓度之间(P<0.05)。10 mg·mL-1TraT2A对5种作物的活力指数促生效果最为明显,促生率最大,其次是发芽指数,对种子发芽率的促生率最低(图1)。除发芽率之外,黄瓜种子的发芽指数和活力指数促生率均最高,且和其他作物的促生率之间存在显著差异;玉米的发芽率、小麦的发芽指数和小麦的活力指数促生率最低,其他作物的上述3个指标促生率介于二者之间(P<0.05)。

表1 深绿木霉TraT2A对5种作物种子萌发的影响Table 1 Effects of TraT2A from T. atroviride on seed germination of five plants

2.2 深绿木霉发酵液蛋白提取物TraT2A对5种作物幼苗生长的影响

由表2可知,4种不同浓度TraT2A处理5种作物幼苗后,其胚根、胚轴、鲜质量和干质量均显著高于对照(P<0.05),且对不同作物的促生效果不同。其中10 mg·mL-1TraT2A促生作用最为显著,5种作物的胚根、胚轴、鲜质量和干质量均最大,尤其对玉米的胚根、胚轴、鲜质量和干质量促生效果最好,分别为10.24、2.78、4.25 cm和0.98 cm,相比对照分别提高了35.63%、26.17%、22.81%和53.14%;而100 mg·mL-1TraT2A促生效果最差,其中小麦的鲜质量和辣椒的干质量最低,分别为1.84 g和0.31 g,但均高于对照(表2),其他浓度处理的作物鲜质量和干质量值均介于二者之间(P<0.05)。由图2可见,10 mg·mL-1TraT2A对5种作物的干质量促生效果最为明显,其次是胚根、胚轴,对鲜质量促生率最低。除黄瓜和小麦干质量促生效果无差异外,10 mg·mL-1TraT2A对黄瓜的胚根、鲜质量和干质量促生效果最好,并与其他作物差异显著(P<0.05),对豇豆干质量以及小麦、玉米和豇豆的胚根促生效果最差。10 mg·mL-1TraT2A对辣椒胚轴促生效果最好,与其他作物胚轴之间差异显著(P<0.05);对玉米胚轴的促生效果最差。小麦与玉米和黄瓜的鲜质量促生效果无显著差异,促生率均较高;对豇豆鲜质量的促生效果最差,其促生率显著低于其他作物(P<0.05)。

图2 10 mg·mL-1 TraT2A对5种作物胚根、胚轴、鲜质量和干质量的促生效果Fig.2 Effects of 10 mg·mL-1 TraT2A on radicle, hypocotyl, fresh mass and dry mass of five crops

表2 深绿木霉TraT2A对5种作物幼苗生长的影响Table 2 Effects of TraT2A from T. atroviride on seedling growth of five plants

2.3 深绿木霉发酵液蛋白提取物TraT2A对5种作物幼苗生理生化特性的影响

由表3可知,10 mg·mL-1的TraT2A处理5种作物幼苗后,与对照相比明显提高了5种作物叶绿素含量和根系活力,同时降低了丙二醛含量(P<0.05)。10 mg·mL-1TraT2A处理5种作物后,小麦叶绿素含量和辣椒根系活力最小,分别为0.0636 mg·g-1和120.67 μg·g-1·h-1,均高于对照(0.0509 mg·g-1和98.00 μg·g-1·h-1);豇豆丙二醛含量最大为0.0310 nmol·g-1,低于对照(0.0410 nmol·g-1)。10 mg·mL-1TraT2A处理5种作物后,对丙二醛含量影响最大,其次是叶绿素含量,对根系活力影响最小。由图3可见,10 mg·mL-1TraT2A对小麦的叶绿素含量和丙二醛含量影响最大,且和其他作物之间存在显著差异(P<0.05);对黄瓜丙二醛含量和玉米叶绿素含量影响最小;对辣椒根系活力提高最大,对黄瓜根系活力提高最小(图3),且二者根系活力与其他作物间差异显著(P<0.05)。

图3 10 mg·mL-1 TraT2A对5种作物叶绿素含量、根系活力和丙二醛含量的影响Fig.3 Effects of 10 mg·mL-1 TraT2A on chlorophyll content, root activity and MAD content of five crops

表3 深绿木霉TraT2A对5种作物幼苗生理特性的影响Table 3 Effect of TraT2A from T. atroviride on physiological characteristics of five crops

3 讨 论

发芽率、发芽指数和活力指数是检验种子质量的重要指标,它们的值越大,种子的活力、发芽的速率以及生长量就更好。张树武等[28-29]研究表明,不同稀释倍数的深绿木霉发酵液均可促进黑麦草和白三叶草种子发芽,其中100倍发酵液处理黑麦草和白三叶草种子后,发芽率、发芽指数和活力指数分别是94.42%和96.55%,13.42和37.41,9.52和7.83,与CK相比显著提高。本研究中,4种不同浓度的TraT2A处理5种作物种子后,与对照相比发芽率、发芽指数和活力指数均有显著提高(P<0.05)。尤其是10 mg·mL-1TraT2A处理的5种作物的发芽率、发芽指数和活力指数均为最高,分别是93.66%、15.16和12.55,与对照发芽率、发芽指数和活力指数(80.00%、13.58和7.37)相比,分别提高了16.64%、11.63%和70.31%(表1),与上述研究结果一致。

根系是直接吸收土壤中水分、无机盐的重要器官,发达的根部能够更好地起到固定和支持作用,根系形态的变化能直接影响植物生长状况[13]。鲜质量和干质量是恒量植物生长的重要指标,其值越大代表植物生长越健壮。叶绿素是高等植物进行光合作用的一类绿色色素,植物正常生长需要高效的光合作用提供能量,叶绿素含量是光合作用强弱的重要指标[30]。梁松等[13]研究表明,深绿木霉T1处理番茄幼苗后,其根长、鲜质量、干质量和SPAD值相比对照分别提高了34.91%、30.27%、15.04%和20.75%。张树武等[28-29]研究表明,100倍稀释液处理的黑麦草和白三叶草幼苗根系长度、鲜质量和干质量的相对增长率分别为16.95%和37.09%,40.57%和57.73%,73.68%和54.35%,叶绿素的相对增长率分别为84.09%和14.02%。本研究中,4种不同浓度的TraT2A处理5种作物幼苗后,胚根、胚轴、鲜质量和干质量均显著高于对照(P<0.05),尤其10 mg·mL-1TraT2A促生作用最为显著,促生率最大值分别为35.63%、26.17%、22.81%、53.14%,且10 mg·mL-1的TraT2A处理5种作物幼苗后,与对照相比明显提高了5种作物叶绿素含量和根系活力(P<0.05),最大增长量分别是24.95%和23.14%,与前人研究结果基本一致。

丙二醛的积累会对细胞质膜等造成伤害,所以试验中通常利用丙二醛的含量作为膜脂过氧化指标,木霉处理后可通过减少MDA积累以防止膜脂的过氧化作用[31]。罗军等[30]发现,与核盘菌处理相比深绿木霉处理的碧玉莴笋MDA最大降幅为29.48%。梁巧兰等[18]用TraT2A 100×液处理兰州百合植株3 d后挑战接种灰霉菌(B.cinerea),将灰霉菌和兰州百合植株分别共同培养1、3、5 d时,百合叶片中的丙二醛含量分别是对照的0.68、0.40、0.51倍。刘畅等[31]研究表明,施加绿色木霉后,黄瓜幼苗中MDA含量有所降低,说明绿色木霉对黄瓜幼苗的生长起到了促进作用。本研究中,10 mg·mL-1TraT2A处理5种作物后,与对照相比明显降低了5种作物丙二醛含量 (P<0.05),最大降幅为36.69%,试验结果与前人研究一致。

伍晓丽等[32]研究发现,深绿木霉发酵液原液处理的青蒿种子和幼苗与对照相比,发芽率、发芽势和发芽指数分别下降了31.06%、54.09%和35.62%,株高减少15.27%,根粗增加了8.99%,地上部干质量增加了11.76%,可见深绿木霉发酵液原液浸泡种子后,不仅会抑制种子发芽,还会使青蒿苗变粗变矮。本文初步明确了试验条件下4种不同浓度的TraT2A对5种作物发芽、幼苗生长以及生理特性的影响,其促生作用机理和田间试验效果还有待进一步研究。

4 结 论

通过研究深绿木霉T2发酵液中的蛋白提取物TraT2A对小麦、玉米、豇豆、辣椒和黄瓜种子、幼苗生长指标和生理特性的影响,探究了TraT2A对5种作物的促生作用。研究表明,4种不同浓度TraT2A对小麦、玉米、豇豆、辣椒和黄瓜的种子和幼苗具有显著的促生作用,10 mg·mL-1处理促生效果最好,对辣椒发芽率、黄瓜发芽指数和黄瓜活力指数的影响最显著,其促生率分别是17.65%、46.46%、91.86%;同时,10 mg·mL-1TraT2A对黄瓜胚根、辣椒胚轴、小麦鲜质量和黄瓜干质量的促生效果最好,促生率分别是46.28%、70.17%、23.26%、104.69%。此外,TraT2A处理5种作物幼苗后,与对照相比叶绿素含量和根系活力明显提高(P<0.05),其中小麦叶绿素含量的促生率最大,为24.95%;辣椒根系活力的促生率最大,为23.14%。TraT2A处理使5种作物幼苗的丙二醛含量明显降低(P<0.05),小麦降幅最大,为36.69%。因此,4种不同浓度的TraT2A处理5种作物后,10 mg·mL-1TraT2A对黄瓜的促生效果最好,其次为辣椒和小麦。