自拟加味白头翁汤通过调节Drp1/LC3改善急性UC小鼠结肠上皮细胞线粒体功能的研究*

代汝伟 高志远 王 欣 郑舒文 徐智广△

（1.沧州医学高等专科学校，河北 沧州 061001；2.河北省沧州中西医结合医院，河北 沧州 061001；3.山东中医药大学，山东 济南 250014）

溃疡性结肠炎（UC）是以直肠和乙状结肠的黏膜和黏膜下层为主要病变的炎症性疾病，临床表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重，或伴有体质量减轻、恶心、呕吐等。近年来我国UC 发病率逐年上升［1-3］。但病因尚不明确，治疗缺乏特异性。因此，寻求安全有效的治疗手段，深入探讨其作用机制仍是UC 研究的热点。

中医学认为UC 属本虚标实，由感受外邪、饮食失节、情志内伤等多种病因引起脾胃虚弱，中焦运化失司，湿热内壅致病［4］。白头翁汤出自《伤寒论·辨厥阴病脉证并治》“热利下重者，白头翁汤主之”，具有清热解毒的功效，是治热毒血痢之主方。临床医家多在白头翁汤原方上加味，通过调整肠道微生物、修复肠黏膜屏障、改善线粒体功能起到治疗作用［5-7］。线粒体动力和自噬是维持线粒体功能的基本形式，研究表明线粒体动力和自噬在结肠黏膜上皮细胞的发育和活性中发挥着关键作用，肠黏膜上皮细胞线粒体分裂融合不平衡及过度自噬会导致黏膜上皮细胞发育停滞，甚至凋亡［8-11］。在前期临床研究基础上，为进一步揭示自拟加味白头翁汤对UC 结肠黏膜上皮细胞线粒体动力和自噬的影响，本研究应用DSS 构建急性UC 模型，灌胃自拟加味白头翁汤治疗，探讨加味白头翁汤与黏膜上皮细胞线粒体动力、自噬的关系，从分子层面为加味白头翁汤治疗UC提供数据支持。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性C57BL/6 小鼠48 只，体质量18～20 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006，饲养于沧州医学高等专科学校科技实验动物中心，恒温（22±2）℃，相对湿度40%～70%，自由摄食饮水，适应性喂养7 d 开展后续相关实验。本实验通过沧州医学高等专科学校动物实验伦理委员会批准。

1.2 实验药物

加味白头翁汤（白头翁30 g，黄连6 g，黄柏10 g，三七10 g，秦皮9 g，槐花30 g，黄芪10 g，虎杖10 g，金银花20 g，青蒿10 g，炙甘草9 g），生药购自河北省沧州中西医结合医院，浸泡30 min，煮沸后微沸10 min，滤出头煎药渣加水再煮，沸后10 min，合并2 次煎液，加热浓缩至100 mL，生药浓度1.54 g/mL。美沙拉嗪肠溶片（葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司，国药准字H19980148，规格：0.25 g×24片）。

1.3 试剂与仪器

苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（碧云天生物科技有限公司，货号C0105M），抗兔二抗（Servicebio，货号GB23303），免疫组化试剂盒（博士德，货号SA1023），聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白定量试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号PC0050），HSP60 一抗（北京索莱宝科技有限公司，货号K000489P），Drp1 一抗（proteintech 公司，货号12957-1-AP）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）一抗（proteintech 公司，货号14600-1-AP），抗兔荧光二抗（Servicebio，货号GB23303），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（Servicebio，货号GB12002），线粒体分离试剂盒（碧云天，货号C3606），ATP 含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号BC0300），线粒体复合物Ⅰ/Ⅲ活性试剂盒（Abbkine 公司，货号KTB1870），小鼠超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（ELISA KIT，货号CB10221-Mu），小鼠白细胞介素-6（IL-6）试剂盒（ELISA KIT，货号CB10187-Mu），Mdivi-1（Sigma，货号338967-87-6），Rapamycin（MedChemExpress，货号3123-88-9），RIPA 裂解液，增强化学发光法（ECL）超敏发光液（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为R0010、PE0010）。FORMA700 型超低温冰箱（美国Thermo 公司）；CR21G 型离心机（日本日立公司）；Direct-Q with pump 型超纯水仪（美国Millipore 公司）；CKX31 型奥林巴斯倒置相差显微镜（日本奥林巴斯公司）；紫外分光光度计（上海精密仪器有限公司，UV-2202PCST）；酶标仪（赛默飞公司，K3）；酶标检测仪（Rayto，Rt2100c）；凝胶扫描仪（EPSON，V300）。

1.4 模型制备

48 只SPF 级C57BL/6 小鼠随机分为空白组、模型组、美沙拉嗪组，加味白头翁汤高、中、低剂量组，每组8 只，自由饮食。参考相关文献，空白组小鼠自由饮用蒸馏水，其他组小鼠自由饮水3.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）7 d 复制急性UC 模型，以小鼠疾病活动指数（DAI 评分）较正常组显著增高及结肠上皮黏膜不完整、炎症细胞浸润、腺体萎缩为模型成功建立依据［12-13］。

1.5 干预方法

模型建立后，每天16∶00 灌胃，连续7 d，根据“人与小鼠之间用药剂量换算表”计算出灌胃量，其中空白组灌蒸馏水，美沙拉嗪组灌胃美沙拉嗪（100 mg/kg），加味白头翁汤3 个剂量组分别按高剂量（108 g/kg）、中剂量（54 g/kg）、低剂量（27 g/kg）灌胃。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 小鼠疾病活动指数评分（DAI 评分）观察 观察小鼠毛发、活动度整体状态，隔天称重，给药后记录各组小鼠体质量、大便性状及便血情况，并进行评分。

1.6.2 结肠上皮SOD、IL-6 含量检测 参照试剂盒说明书，组织匀浆制备样本稀释液，酶标仪450 nm 波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

1.6.3 HE 染色观察小鼠结肠上皮形态 治疗结束后各组小鼠禁食不禁水，第2 天1%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉（50 mg/kg），腹主动脉取血，分离血清置于-80 ℃冰箱待测。冰上分离出盲肠至肛管上3 mm处结肠，测量长度后生理盐水冲洗，置4%多聚甲醛中固定72 h。经脱水、石蜡包埋后切片（0.04 μm），HE 染色，光学显微镜下观察结肠上皮细胞黏膜完整性，腺体结构，炎性细胞数量。

1.6.4 线粒体复合物Ⅰ/Ⅲ、ATP 活性测定 参考索莱宝ATP含量检测试剂盒说明，提取小鼠血清中ATP，于340 nm 波长处测紫外分光光度值，计算ATP含量［ATP含量（μmol/mL）=6.875×Δ 测定÷ΔA 标准］。参考Abbkine 试剂盒说明，应用酶标仪550 nm 检测小鼠线粒体复合物Ⅰ/Ⅲ［线粒体复合物Ⅲ（U/g fresh weight）=1 243×ΔA÷W；线粒体复合物Ⅰ（U/g fresh weight）=3 654×ΔA÷W］。

1.6.5 透射电子显微镜观察结肠上皮线粒体结构 取下1 mm×1 mm×1 mm 结肠上皮组织，立即置于2.5%戊二醛固定液中固定，经脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色后，投射电镜下观察线粒体形态及自噬小体。

1.6.6 Drp1、LC3 蛋白的表达 1）免疫组织化学法（IHC）检测：取未染色切片，用3%H2O2室温封闭10 min，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3 次，置于0.01%枸橼酸盐缓冲液中，微波抗原修复，闭光孵育封闭，分别加入Drp1、LC3 一抗，4 ℃过夜后孵育二抗，DAB 显色后封片，显微镜拍照测定吸光度。2）免疫荧光定位：在“1.6.5”项下方法基础上，使用荧光二抗，荧光电子显微镜观察Drp1、LC3 蛋白的定位表达情况。3）Western blotting 测定：提取并分离结肠上皮线粒体蛋白，PAGE凝胶电泳并转膜，1%BSA 封闭，4 ℃一抗过夜，结合二抗，避光检测。

1.7 统计学处理

图片分析采用Image Pro Plus 5 软件分析，使用SPSS25.0 软件分析数据，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠一般情况及DAI评分比较

见表1。治疗周期结束后，记录各组小鼠第1～14日体质量、便血情况和生存情况。与模型组相比，空白组小鼠一般情况良好，毛色明润光泽，反应灵敏，大便正常。模型组则懒动、反应迟钝、毛色灰暗、体质量下降，并出现稀便甚至血便。给予加味白头翁汤高剂量治疗，情况改善，小鼠活动增多，大便明显好转，DAI分数较模型组显著降低（P＜0.05）。

表1 各组小鼠一般情况及DAI评分比较（分，±s）

表1 各组小鼠一般情况及DAI评分比较（分，±s）

注：与空白组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05。下同。

组 别空白组模型组美沙拉嗪组加味白头翁汤高剂量组加味白头翁汤中剂量组加味白头翁汤低剂量组n8 8 8 8 8 8体质量下降—3.51±0.84 1.66±0.55△0.67±0.52△2.45±0.45 3.62±0.67大便性状—3.31±0.82 2.47±0.55△2.33±0.82△2.91±0.56 3.17±0.64隐血—3.51±0.84 2.29±0.45△2.67±0.52△3.13±0.72 3.29±0.64 DAI—1.17±0.41 1.60±0.27△1.53±0.45 1.08±0.22 1.13±0.39

2.2 各组小鼠结肠长度比较

见图1、表2。截取盲肠至肛管上3 mm 处结肠，测量其长度。结果显示，模型组结肠显著缩短，与模型组比较，美沙拉嗪组及加味白头翁汤高剂量组差异具有统计学意义（P＜0.05），而加味白头翁汤中剂量、低剂量对模型小鼠结肠长度无影响。

图1 各组小鼠结肠长度

表2 各组小鼠结肠长度比较（cm，±s）

表2 各组小鼠结肠长度比较（cm，±s）

组 别空白组模型组美沙拉嗪组加味白头翁汤高剂量组加味白头翁汤中剂量组加味白头翁汤低剂量组n8 8 8 8 8 8结肠长度9.86±0.51△2.01±0.47 5.36±0.25△4.55±0.38△3.45±0.35 3.27±0.22

2.3 各组小鼠结肠组织中SOD、IL-6含量比较

见表3。与空白组比较，UC 小鼠结肠组织中SOD显著降低，而炎症因子IL-6明显高表达（P＜0.05）。与模型组比较，美沙拉嗪组与加味白头翁汤高剂量组SOD 水平明显上升，IL-6 水平则明显降低（P＜0.05），且加味白头翁汤高剂量组与美沙拉嗪组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；而加味白头翁汤中剂量、低剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。提示加味高剂量白头翁汤可以抑制DSS 诱导的急性UC 黏膜组织的炎症反应。

表3 各组小鼠SOD、IL-6含量比较（±s）

表3 各组小鼠SOD、IL-6含量比较（±s）

组 别空白组模型组美沙拉嗪组加味白头翁汤高剂量组加味白头翁汤中剂量组加味白头翁汤低剂量组n8 8 8 8 8 8 SOD（U/mL）72.13±15.68 24.75±5.20*63.18±11.04△59.74±10.26△41.03±10.72 37.66±8.43 IL-6（pg/mL）132.71±29.02 427.69±73.77*215.12±48.35△238.20±44.76△366.37±72.01 396.17±51.63

2.4 各组小鼠结肠上皮组织病理学比较

与模型组相比，美沙拉嗪组及加味白头翁汤高剂量组炎症细胞浸润显著减少，但加味白头翁高剂量组仍可见轻度的腺体萎缩。见图2。

图2 各组小鼠结肠黏膜损伤情况（HE染色，400倍）

2.5 各组小鼠结肠上皮线粒体ATP、线粒体呼吸链复合物Ⅰ/Ⅲ比较

见表4。与模型组比较，空白组、美沙拉嗪组以及加味白头翁汤高剂量组ATP、线粒体呼吸链复合物Ⅰ/Ⅲ均呈现高表达（P＜0.05）。

表4 各组小鼠结肠上皮线粒体ATP、线粒体呼吸链复合物Ⅰ/Ⅲ比较（±s）

表4 各组小鼠结肠上皮线粒体ATP、线粒体呼吸链复合物Ⅰ/Ⅲ比较（±s）

组别空白组模型组美沙拉嗪组加味白头翁汤高剂量组加味白头翁汤中剂量组加味白头翁汤低剂量组n8 8 8 8 8 8 ATP（μ/mol）66.31±10.24△38.19±4.74 56.26±9.59△49.63±7.52△40.85±8.29 43.12±4.07线粒体复合物Ⅲ（U/g）107.23±13.88△59.41±14.02 82.03±11.65△70.69±8.21△52.79±5.56 49.77±7.64线粒体复合物Ⅰ（U/g）144.80±39.51△53.45±9.34 88.29±10.05△79.66±13.35△60.13±8.99 63.29±7.12

2.6 各组小鼠结肠上皮线粒体动力和自噬比较

与空白组比较，模型组结肠上皮线粒体LC3 高表达（P＜0.05）；与模型组比较，加味白头翁汤高剂量组以及美沙拉嗪组LC3 蛋白含量表达呈不同程度升高，但无显著差异（P＞0.05）；与空白组比较，模型组结肠上皮Drp1表达明显升高（P＜0.05），这种趋势同样出现在加味白头翁汤中、低剂量组；与模型组比较，加味白头翁汤高剂量组以及美沙拉嗪组Drp1 表达均有不同程度降低（P＜0.05）。见图3、表5。美沙拉嗪组与加味白头翁汤高剂量组Drp1、LC3 高表达，趋势一致，且Drp1、LC3共定位，相互影响，见图4。透射电子显微镜观察结肠组织线粒体的分裂和自噬情况，结果显示，较空白组，模型组线粒体明显肿胀变形，分裂增多，且存在自噬激活状态；而美沙拉嗪组和加味白头翁汤高剂量组分裂减少，自噬激活明显增多，见图5。应用了分裂抑制剂Mdivi-1 和自噬激活剂雷帕霉素（Rap），WB结果显示，与模型组比较，美沙拉嗪组和加味白头翁汤高剂量组LC3Ⅱ/Ⅰ显著高表达（P＜0.05），然而使用Mdivi-1后，加味白头翁汤高剂量+Mdivi-1组LC3Ⅱ/Ⅰ表达较加味白头翁汤高剂量组显著降低（P＜0.05），使用Rap 后，自噬明显被激活（P＜0.05）；与空白组比较，模型组Drp1 表达显著下降（P＜0.05），美沙拉嗪组和加味白头翁汤组能够改变这种趋势，促进Drp1高表达（P＜0.05），在加味白头翁汤基础上使用Mdivi-1，Drp1表达显著降低（P＜0.05），并且施加Rap并未对Drp1表达造成影响（P＞0.05），见图6、表6。

图3 各组小鼠线结肠上皮线粒体Drp1、LC3表达的影响（IHC，400倍）

图4 各组小鼠结肠上皮线粒体Drp1、LC3表达的影响（IHC，200倍）

图5 各组小鼠结肠上皮线粒体分裂及自噬的影响（TEM，600倍）

图6 各组大鼠结肠上皮线粒体Drp1及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达的影响

表5 各组小鼠结肠上皮Drp1及LC3蛋白表达比较（±s）

表5 各组小鼠结肠上皮Drp1及LC3蛋白表达比较（±s）

组 别空白组模型组美沙拉嗪组加味白头翁汤高剂量组加味白头翁汤中剂量组加味白头翁汤低剂量组n8 8 8 8 8 8 LC3 35.36±7.86△69.85±11.32*60.80±12.75*67.38±10.97*44.73±9.69 55.24±10.18 Drp1 22.46±5.31△44.94±9.37*29.49±6.09△18.06±4.52△51.84±9.91 40.91±9.58

表6 各组小鼠结肠上皮线粒体Drp1及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比较（±s）

表6 各组小鼠结肠上皮线粒体Drp1及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比较（±s）

注：与加味白头翁汤高剂量组比较，▲P ＜0.05。下同。

组 别空白组模型组美沙拉嗪组加味白头翁汤高剂量组加味白头翁汤高剂量+Mdivi-1组加味白头翁汤高剂量+Rap组n8 8 8 8 8 8 LC3Ⅱ/Ⅰ0.34±0.05△0.50±0.12*0.67±0.06△*0.73±0.10△*0.63±0.07*▲0.75±0.13△*Drp1 0.66±0.09△0.30±0.06*0.51±0.11△0.42±0.09△0.29±0.06*0.50±0.10△

3 讨 论

中医学将UC 归属为“泄泻”“休息痢”“肠风”等范畴，病机为本虚标实，由多种病因引起脾胃虚弱，中焦运化失司，湿热内壅大肠致病［4-5，14］。白头翁汤出自张仲景《伤寒论》，由白头翁、黄连、黄柏、秦皮4味药物组成。该方以白头翁清热解毒、凉血止痢为君；黄连、黄柏、秦皮清热燥湿、泻火解毒为臣。白头翁汤是治疗痢疾的经方。有研究表明，白头翁汤可修复UC小鼠结肠组织黏膜组织局部损伤，降低血清与结肠组织中IL-1β 与TNF-α 水平，抑制炎症因子表达［6］。基于白头翁汤具有抗菌、抗炎、修复溃疡等作用［7，15］，借助现代整合药理学平台（TCMIP）、靶标网络构建等数据分析及《溃疡性结肠炎中医诊疗共识意见》，本研究在白头翁汤基础上进行加味，应用了清热利湿、凉血通便的青蒿，有益消炎退热降温［16-17］；虎杖祛风除湿，其有效成分白藜芦醇能抗氧自由基［18-19］。加味白头翁汤中青蒿、虎杖与金银花、黄芪、槐花、炙甘草等同用，共奏益气除湿、清热解毒之效。

本研究采用3.5%DSS 7 d 建立急性UC 小鼠模型，与空白组小鼠比较，UC 小鼠结肠黏膜腺体受损严重，腺体萎缩，隐窝分支。组织病理学评分提示，模型组小鼠病理改变明显升高，稳定复制了急性UC模型。

有研究表示，地马煎剂可干预UC 大鼠模型，通过激活HIF-1α/BNIP3/Beclin-1 线粒体自噬通路进而对抗炎症活动［20］。本研究同样也证实，自拟加味白头翁汤高剂量组可显著改善急性期UC小鼠结肠上皮炎症，组织中SOD 升高，而IL-6 明显下降，病理组织切片炎症细胞浸润显著减少；小鼠活动增多，大便明显好转，DAI分数较模型组显著降低。

氧化应激和自噬异常与UC炎症存在密切联系，而线粒体是造成氧化应激、自噬的基础。线粒体自噬通过清除功能失调的细胞器来保持细胞活性，旨在限制ROS 等氧化因子，抑制炎症的产生［8-10］。线粒体动力蛋白（OPA1/Drp1）维持着线粒体的动态活性；一旦线粒体融合和裂变失常，可能引发异常线粒体聚集，导致线粒体自噬受损［11］。所以，线粒体自噬受损也可能是UC 肠黏膜上皮细胞损伤的重要潜在因素。为了探讨线粒体自噬对急性UC 肠黏膜上皮细胞损伤的影响及其是否参与加味白头翁汤的药效调节，我们首先应用紫外分光光度仪和酶标仪，分别检测小鼠结肠上皮线粒体ATP、线粒体呼吸链复合物Ⅰ/Ⅲ的表达情况。结果显示，与模型组比较，空白组、美沙拉嗪组以及加味白头翁汤高剂量组的ATP、线粒体呼吸链复合物Ⅰ/Ⅲ均呈现高表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）。免疫组化观察到，模型组结肠上皮线粒体LC3 及Drp1 高表达，加味白头翁汤高剂量组以及美沙拉嗪组Drp1 表达均有不同程度降低，证实加味白头翁汤高剂量组能够改善线粒体活性，激活线粒体自噬蛋白LC3，减少分裂蛋白Drp1 表达。免疫荧光和透射电子显微镜，观察到加味白头翁汤高剂量组LC3 与Drp1 共定位，表明其药效的发挥是线粒体自噬与分裂的相互作用。

进一步解析加味白头翁汤治疗UC的机制，在加味白头翁汤基础上，分别施加了自噬的激活工具药物雷帕霉素Rapamycin，线粒体分裂的抑制剂Mdivi-1（具有选择性和细胞穿膜性，抑制Drp1）。结果表明，加味白头翁汤高剂量组自噬活性（LC3Ⅰ向Ⅱ转化率）和分裂蛋白Drp1 明显高于模型组，这也验证了当线粒体分裂开始时，胞质中的Drp1 会被招募至线粒体外膜表面，与外膜表面上的线粒体分裂因子结合，并导致线粒体的内外膜向内凹陷Drp1聚集在凹陷部位，最终导致内外膜的断裂，使一个线粒体分裂成两个子线粒体［21-22］，然后引发正常的自噬激活。施加Mdivi-1 后，Drp1 表达下降，同时自噬活性受到抑制，然而，加Rap后，仅加大了LC3Ⅱ/Ⅰ的表达，并没有改变Drp1 的表达，该结果表明线粒体分裂处于自噬的上游，加味白头翁汤通过增加线粒体外膜Drp1 的聚集而激活自噬，减轻UC 炎症。IHC 和WB 检测的LC3 及Drp1 结果呈现并不完全一致，正是因为胞质和线粒体膜位置的不同。

综上所述，本研究初步表明了加味白头翁汤对急性UC小鼠结肠黏膜炎症有一定的改善和修复作用，机制可能是通过增加线粒体分裂蛋白Drp1、激活自噬、减少IL-6 等炎症因子，最终达到治疗UC 的作用。这一发现为阐述中医药治疗UC 机制提供了实验依据。下一步本课题组将分析加味白头翁汤与线粒体融合因子的相关性，并分析其对自噬的影响及其信号通路。