安脑平冲汤调控基于BDNF/TrkB信号通路对脑出血大鼠的脑神经保护作用研究*

陈小红 刘艳华 王 旭 周旭晴 周德生 雷诗卉 杨 益 郭 纯

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

脑出血（ICH）是临床常见的脑卒中亚型，具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点。在全球范围内，ICH约占全部脑卒中的27.9%，我国大多数地区每年的发病率达到了48.6～57.4/10 万人［1］，ICH 的病死率在1个月内约为40%，1年内约为54%，只有12%～39%的患者能够实现长期的功能独立［2］，已经严重影响了居民的健康，并造成了沉重的家庭经济负担。ICH 的病理机制非常复杂，至今尚未完全阐明，由血肿及红细胞裂解产物等引起的继发性脑损伤（SBI）是ICH 后长期的病理损伤中关键的破坏性事件，而神经元凋亡是SBI的主要机制之一［3］。广泛分布于神经系统中的脑源性神经营养因子（BDNF）能促进神经元及突触的形成、维持神经元形态、增强神经细胞的可塑性，并能抑制ICH后SBI的进一步发展［4］。

安脑平冲汤是湖南中医药大学第一附属医院治疗ICH 的经验方，临床应用多年，具有显著减轻ICH 患者脑水肿和促进神经功能恢复的作用［5-6］。本实验通过建立ICH 大鼠模型，观察安脑平冲汤对ICH 模型大鼠血肿周围脑组织中BDNF/TrkB信号通路及神经细胞凋亡的影响，探讨其在ICH 后的脑神经保护作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 10～12 周清洁级SD 雄性健康大鼠72只，体质量250～280 g，购自湖南斯莱克达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。动物饲养在湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心，使用许可证号：SYXK（湘）2020-0010。饲养条件：（23±2）℃，相对湿度40%～60%，自由进食、饮水。实验遵循实验动物伦理规范，由湖南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物 安脑平冲汤：生龙骨30 g（先煎），生牡蛎30 g（先煎），川牛膝15 g，白蒺藜12 g，钩藤12 g（后下），泽泻12 g，牡丹皮12 g，栀子12 g，黄芩12 g，白芍12 g，大黄9 g（后下），甘草6 g。饮片均购自湖南中医药大学第一附属医院药房，以10 倍水煎煮后水浴浓缩至1.5 g 生药/mL，4 ℃冰箱备用。奥拉西坦片（石药集团欧意药业有限公司，国药准字号H20031033；规格：0.4 g/片）用时配制为21.6 mg/mL溶液。

1.3 试剂与仪器 尼氏染色液，北京Solarbio（G1430）；Tunel凋亡检测试剂盒，上海碧云天（C1091）；BCA蛋白浓度测定试剂盒，北京Biosharp（BL521A）；RIPA 裂解液，武汉博士德（AR0105）；超敏ECL 化学发光盒，北京Biosharp（BL523A）；重组Anti-BDNF 抗体，英国abcam（ab108319）；重组Anti-TrkB抗体，英国Abcam（ab187041）；重组Anti-Bcl-2 抗体，英国abcam（ab182858）；重组Anti-Bax抗体，英国Abcam（ab182733）；Goat Anti-Rabbit IgG，北京Biosharp（E030120）。68025 标准型单臂脑立体定位仪（瑞沃德）；AUW120D 精密电子天平（日本岛津）；Z32HK 高速冷冻离心机（贺默）；Enspire 多功能酶标仪（美国Perkinelmer）；BX43 荧光显微镜（奥林巴斯）；FluorChem R 多功能分子定量分析系统（美国Proteinsimple）；Mini Protean tetra cell 蛋白印记系统（伯乐）；超灵敏多色荧光成像分析系统（美国Protein-Simple）。

1.4 模型制备 大鼠适应性喂养3～4 d，术前6 h 内禁食。术时以25%乌拉坦腹腔注射麻醉，心脏采血100 μL。大鼠俯卧位固定在脑立体定位仪上，前囟与后囟保持在统一水平上，头顶备皮消毒，正中切开1 cm，暴露颅骨，于冠状缝前1 mm，中线左旁开3 mm 处钻开约1 mm 小孔，垂直向下进针。参考周中和等［7］提供的二次注血退针法，微量注射器针头与钻孔的方向垂直进针6 mm 到达尾状核处，先匀速注血50 μL，停止注血5 min，然后再次匀速注血50 μL，针留10 min后退针约2 mm，再次停针4 min 后将针拔出，缝合头皮、消毒。将大鼠保温至苏醒后分笼喂养。

1.5 分组及给药 将大鼠随机分为假手术组和造模组，造模组大鼠采用自体血注射法进行造模，造模成功后随机分成模型组、安脑平冲汤组、奥拉西坦组，每组分1、3、7 d 3 个时间点，每个时间点6 只。根据体表面积-剂量换算法，各组于苏醒后均以0.5 mL/100 g 给药1 次，之后每隔12 h 给药1 次，每日2 次。假手术组、模型组予蒸馏水灌胃，治疗组分别予安脑平冲汤（1.5 g生药/mL）和奥拉西坦水溶液（21.6 mg/mL）。根据各组相应时间点对应的天数给药，给药期间各组动物均自由活动、进食。

1.6 神经功能评分 采用改良神经功能缺损评分法（mNSS）进行大鼠神经功能评判，其中提尾试验（0～3分）、行走试验（0～3 分）、感觉试验（0～2 分）、平衡木试验（0～6 分）、反射丧失和不正常运动（0～4 分），最高18分。0 分为神经功能未受损伤，1～6 分为轻度损伤，7～12分为中度损伤，13～18分为重度损伤。

1.7 标本采集与检测 1）脑组织尼氏染色及Tunel染色。各组每个时间点随机选3只大鼠，末次灌胃后2 h，麻醉后用4%多聚甲醛经左心室灌注固定，取全脑，于4%多聚甲醛中固定1 d 以上，常规脱水、石蜡包埋，切片厚5 μm，脱蜡，严格按照尼氏染色和Tunel染色试剂盒说明书步骤进行操作，染色后于显微镜下观察，Tunel染色切片于血肿周围随机选取3 个不重叠视野，计算细胞凋亡率（凋亡细胞数÷总细胞数×100%）。2）Western blotting 检测BDNF、脑源性神经营养因子受体（TrkB）、兔抗人单克隆抗体（Bax）、Bcl-2 蛋白。各组每个时间点余下3 只大鼠，末次灌胃后2 h，麻醉后取全脑，分离出血周围脑组织于-80 ℃冰箱保存。检测时，提取各组大鼠脑组织总蛋白，BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量，电泳分离总蛋白，转膜封闭后，依次滴加一抗：BDNF（1∶5 000）、TrkB（1∶5 000）、Bax（1∶9 000）、Bcl-2（1∶5 000）、β-actin（1∶6 000）和二抗（1∶8 000）孵育，滴加ECL显影，超灵敏多色荧光成像分析系统下曝光分析。

1.8 统计学处理 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以（±s）表示，检验方法采用t检验或单因素方差分析，组间多重比较采用LSD 法。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.05表示有显著性差异。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 见表1。与假手术组比较，模型组大鼠各时间点（1、3、7 d）神经功能缺损评分明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，安脑平冲汤组、奥拉西坦组3、7 d神经功能缺损评分均有所降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各组大鼠各时间点神经功能缺损评分比较（±s）

表1 各组大鼠各时间点神经功能缺损评分比较（±s）

注：与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与假手术组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同。

组 别假手术组模型组安脑平冲汤组奥拉西坦组n6 6 6 6 1 d 0.00±0.00 13.00±2.10△△11.67±2.07 11.83±1.72 3 d 0.00±0.00 12.50±1.64△△9.83±1.72*10.00±2.10*7 d 0.00±0.00 12.17±2.14△△9.00±1.67**9.17±2.14**

2.2 各组大鼠血肿周围脑组织尼氏染色情况 假手术组各时间点大鼠脑组织细胞排列整齐，尼氏小体包裹在细胞核周边，形态清晰可辨，数量丰富；模型组神经细胞损伤明显，胞核出现固缩、破碎或溶解，尼氏小体固缩减少。给予安脑平冲汤治疗后，胞核固缩、破碎减少，尼氏小体固缩减少得到明显改善，效果优于奥拉西坦，且随着用药时间的延长，改善效果越好。见图1。

图1 各组大鼠各时间点血肿周围脑组织（尼氏染色，200倍）

2.3 各组大鼠血肿周围脑组织细胞凋亡率比较 见图2、表2。显微镜下观察细胞凋亡情况，棕褐色细胞为凋亡细胞。假手术组脑切片显示无棕褐色凋亡细胞；与假手术组相比，模型组和各药物组大鼠各时间点的细胞凋亡率明显增大（P＜0.01）；与模型组相比，安脑平冲汤组、奥拉西坦组各个时间点的细胞凋亡率均降低（P＜0.05或P＜0.01）。

图2 各组大鼠各时间点血肿周围脑组织（Tunel染色，200倍）

表2 各组大鼠各时间点血肿周围脑组织细胞凋亡率比较（%，±s）

表2 各组大鼠各时间点血肿周围脑组织细胞凋亡率比较（%，±s）

组 别假手术组模型组安脑平冲汤组奥拉西坦组n3 3 3 3 1 d 0.00±0.00 98.50±2.60△△31.57±7.73**52.77±9.41*3 d 0.00±0.00 91.10±5.02△△31.77±8.38**60.67±3.87*7 d 0.00±0.00 83.77±2.63△△28.17±8.55**46.30±7.44**

2.4 各组大鼠血肿周围脑组织BDNF、TrkB、Bax、Bcl-2蛋白表达比较 见表3、表4、图3。与假手术组比较，模型组各时间点BDNF、TrkB、Bax 的表达及Bax/Bcl-2值均升高（P＜0.05或P＜0.01），而Bcl-2蛋白的表达明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，安脑平冲汤组各时间点BDNF、TrkB、Bcl-2表达升高（P＜0.05或P＜0.01），Bax 的表达及Bax/Bcl-2 值降低（P＜0.05）；奥拉西坦组3 d的TrkB、BDNF、Bcl-2表达升高（P＜0.05或P＜0.01），所有时间点Bax的表达均降低（P＜0.05或P＜0.01）。

图3 各组大鼠各时间点血肿周围组织BDNF、TrkB、Bax、Bcl-2蛋白电泳条带

表3 各组大鼠各时间点血肿周围脑组织BDNF、TrkB、Bax、Bcl-2蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠各时间点血肿周围脑组织BDNF、TrkB、Bax、Bcl-2蛋白表达比较（±s）

组 别假手术组（n=3）模型组（n=3）安脑平冲汤组（n=3）奥拉西坦组（n=3）时间1 d 3 d 7 d 1 d 3 d 7 d 1 d 3 d 7 d 1 d 3 d 7 d BDNF 0.29±0.07 0.47±0.00 0.43±0.17 0.76±0.17△0.71±0.10△1.00±0.09△1.29±0.27*1.38±0.19**1.43±0.13*1.14±0.28 0.95±0.11*1.25±0.36 TrkB 0.56±0.13 0.56±0.02 0.61±0.12 0.78±0.23△0.78±0.11△1.01±0.11△1.22±0.25*1.22±0.19**1.31±0.10*1.17±0.18 1.17±0.08**1.14±0.25 Bax 0.68±0.05 0.58±0.08 0.47±0.04 1.24±0.22△△1.12±0.25△△1.05±0.02△△0.87±0.22*0.70±0.21*0.68±0.11**0.89±0.09*0.72±0.27*0.70±0.13**Bcl-2 1.31±0.13 1.25±0.18 1.33±0.24 0.63±0.09△△0.57±0.10△△0.47±0.14△△1.15±0.20**1.12±0.01**0.84±0.03*0.84±0.09 0.94±0.13**0.66±0.06

表4 各组大鼠各时间点血肿周围脑组织Bax/Bcl-2值比较（±s）

表4 各组大鼠各时间点血肿周围脑组织Bax/Bcl-2值比较（±s）

组 别假手术组模型组安脑平冲汤组奥拉西坦组n3 3 3 3 1 d 0.52±0.04**2.04±0.57 0.77±0.23**1.08±0.20**3 d 0.47±0.03**1.96±0.18 0.62±0.19**0.75±0.20**7 d 0.36±0.10**2.35±0.70 0.81±0.11**1.07±0.16**

3 讨 论

ICH是非外伤性的脑实质内血管破裂引起的出血，出血后脑实质中的血液诱导的神经元凋亡、细胞毒性、神经炎症、氧化应激、脑水肿等导致SBI［8］。SBI会在血肿周围扩散并对神经元造成持续性的损伤，导致神经元的大量死亡和机体的神经功能受损，致使神经功能难以恢复［9］。本实验研究发现，安脑平冲汤能够降低ICH大鼠的神经功能缺损评分，减少神经元死亡和变性，对神经元起到保护作用，并促进其神经功能恢复。

BDNF 是中枢神经系统多种功能的重要调节因子。在ICH后SBI中，BNDF可识别TrkB受体为损伤的神经元提供必要的营养，发挥神经元存活、分化、神经发生和突触发生等作用，促进损伤后的运动和感觉功能恢复［10］。有研究发现，激活BDNF/TrkB 通路可有效调节大脑氧化应激和神经炎症反应［11］；ICH 后，上调BDNF、TrkB 的表达能诱导M2 小胶质细胞极化，促进神经元和神经功能的恢复［12］。神经元凋亡被认为是SBI的主要机制之一［13］，正常情况下，Bax和Bcl-2蛋白在脑组织中表达水平处于一个相对平衡稳定的状态以调控神经元凋亡［14］。ICH 后，受各种损伤因素影响，Bax 表达水平显著升高，Bcl-2 表达受到抑制，稳态失序，故不能有效抑制细胞凋亡［15］，Bax/Bcl-2 比值是判定细胞凋亡或存活状态的有效指标，Bcl-2家族更被认为是未来治疗继发性脑损伤的强大干预目标［16］。本实验结果发现，ICH 模型大鼠血肿周围脑组织Bax/Bcl-2值和细胞凋亡率均显著提高，而安脑平冲汤可通过上调BDNF、TrkB，调节Bax 和Bcl-2 的表达，降低细胞凋亡率并发挥神经保护作用。

ICH 在中医学属“出血性中风”范畴，其病机主要为阴阳失调，气血逆乱。现代医家提出冲气上逆为出血性中风的关键病机，并根据潜摄冲脉、通调气血的治则创制安脑平冲汤［5］。方中以生龙骨、生牡蛎平肝潜阳，白芍敛肝阴以缓急；以黄芩、栀子清降肺气；大黄通腑以降胃气，泽泻利水化浊，二窍通则邪气去、脑窍清；钩藤清肝息风，白蒺藜平肝解郁、祛风活血，二者质轻兼具风性，易引药上行通达脑络而息风活血开郁；川牛膝、牡丹皮凉血活血、化瘀通络；甘草调和诸药。全方含“平冲、降冲、敛冲”之意，冲气平则气血平，郁滞去则脑络通，脑神清宁。

课题组前期研究发现，安脑平冲汤能够有效抑制大鼠ICH 后SBI 的发生发展，促进神经元和神经功能的恢复［17］。现代药理学研究发现，安脑平冲汤中所含有的中药成分白蒺藜皂苷能够提高BDNF、p-TrkB mRNA 表达，通过BDNF/TrkB 信号通路能有效改善糖尿病视网膜病变［18］。本研究表明，安脑平冲汤可通过激活BDNF/TrkB 信号通路抑制ICH 后神经细胞凋亡，对ICH大鼠具有神经保护作用。