兰茂牛肝菌酶解液的制备工艺优化及滋味评价

张沙沙，杨宁，张微思，罗晓莉，周锫，曹晶晶，孙达锋*

（1.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南昆明 650221）（2.云南省食用菌产业发展研究院，云南昆明 650221）

兰茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica），隶属于牛肝菌科（Boletaceae）、兰茂牛肝菌属（Lanmaoa），盛产于云南、贵州等地，俗称“红葱”[1]。兰茂牛肝菌营养丰富，其子实体粗蛋白含量为56%、粗纤维17%、氨基酸总量为33.40%、矿物质元素为3 820 mg/kg、粗多糖7.20%[2]。兰茂牛肝菌滋味鲜爽，具有独特而浓郁的香气，深受当地人喜爱，目前以鲜食为主，其组织脆嫩，易腐烂变质，保藏困难[3]。但是兰茂牛肝菌有微毒性，烹饪不当可能导致恶心、呕吐、产生幻觉等症状，经适当加热处理后毒性减弱或消失[4-6]，因此对兰茂牛肝菌进行深加工，提取其滋味成分制作调味品，为广大消费者提供方便快捷、安全的兰茂牛肝菌制品。

人们为有效提高牛肝菌呈味物质释放率，增加呈味作用较为明显的小分子物质含量，在产品加工中会采用超声、酶解等多种提取方法[7,8]。其中，酶解法是较为常用的生物提取法，具有污染小、耗能低、反应可控等优点[9]。刘佳等[10]利用白牛肝菌边角料，采用正交试验优化白牛肝菌边角料酶解工艺，其蛋白质水解度为20.16%。黄典等[11]以美味牛肝菌为试验材料，通过响应面法优化酶解工艺，制得的酶解液水解度为34.12%，DPPH·清除率为55.91%。本团队在新鲜兰茂牛肝菌呈味物质研究中，发现兰茂牛肝菌含有丰富的氨基酸、呈味核苷酸、有机酸等可溶性呈味物质，是一种较好的鲜味物质来源[12]。但尚不清楚兰茂牛肝菌酶解液的滋味成分。

本文以兰茂牛肝菌为试验材料，以氨基酸态氮含量为指标，研究中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解兰茂牛肝菌的最适条件和添加量，分析酶解产物的游离氨基酸、呈味核苷酸、有机酸等非挥发性风味物质组成及含量，为满足人们的需求，丰富兰茂牛肝菌精深加工产品类型，提高产品附加值提供重要理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

兰茂牛肝菌鲜品，统货，购于昆明木水花野生菌交易市场。

50 000 U/g中性蛋白酶、30 000 U/g木瓜蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司；50 000 U/g风味蛋白酶，沧州夏盛酶生物技术有限公司。氢氧化钠容量分析用标准溶液，坛墨质检科技股份有限公司；甲醛溶液，西陇科学股份有限公司；HPLC级甲醇溶液、HPLC级乙腈溶液，上海百灵威化学技术有限公司；呈味核苷酸标准品、酒石酸等8种有机酸标准品，上海源叶生物科技有限公司；盐酸（体积分数≥36%），优级纯，重庆川东化工（集团）有限公司；氮气（纯度99.9%），昆明石头人气体产品有限公司；缓冲溶液，英国biochrom公司；氢氧化钠（优级纯），西陇化工试剂有限公司；苯酚（优级纯）、氨基酸标准品溶液（纯度≥99.9%），默克化工技术（上海）有限公司。

1.2 主要仪器设备

5HG-0.3CK果蔬烘干机，云南种业集团有限责任公司；EasyPlusTitrator ET18自动电位滴定仪、FiveEasy Plus FE28 pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅，上海立辰科技有限公司；HR/T20MM离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；TYM-30L超微粉碎机，济南天宇专用设备有限公司；RIGOL L-3000高效液相色谱仪，北京普源精仪科技有限责任公司；HT190R高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；MIX-25旋涡混合器，杭州佑宁仪器有限公司；Biochrom 30+全自动氨基酸分析仪，英国biochrom公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酶解液制备

新鲜兰茂牛肝菌干燥后，采用超微粉碎机粉碎20 min，按料液比1:20（m/m）加水溶解，选取中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶用于兰茂牛肝菌的酶解，酶添加量（以兰茂牛肝菌粉计，m/m）、pH值、酶解温度、酶解时间见表1～6，酶解结束后100 ℃灭酶5 min，离心（4 000 r/min、60 ℃、15 min）取上清液备用，酶解液制备重复3次。

表1 单因素试验因素水平表Table 1 Factor level design table of single factor test

1.3.2 酶解液制备单因素试验

1.3.3 酶解液制备正交试验设计

在单因素试验基础上，中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶分别选取pH值、时间、酶添加量、温度四个因素设计L9（34）正交试验，以氨基酸态氮含量为指标分别确定最佳酶解条件（见表2～表4）。

表2 中性蛋白酶正交试验因素水平表Table 2 Factor levels of orthogonal test of neutral protease

表3 风味蛋白酶正交试验因素水平表Table 3 Factor levels of orthogonal test of flavoring protease

表4 木瓜蛋白酶正交试验因素水平表Table 4 Factor levels of orthogonal test of papain

1.3.4 三种酶复配条件的确定

1.3.4.1 复合酶复配酶解条件优化

基于三种酶的正交试验结果，选取中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶添加量（m/m）分别为0.70%、0.90%、3.70%，以氨基酸态氮为指标，采用L9（34）正交试验将三种蛋白酶酶解条件进行复配（见表5）。

表5 复合酶解条件正交试验因素水平表Table 5 Factor levels of orthogonal test of complex enzyme

1.3.4.2 复合酶添加比例优化

在pH值7.0、温度50 ℃、时间1.5 h的条件下，以中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶三种酶添加量（m/m）为因子，氨基酸态氮为指标，采用L9（34）正交试验将三种蛋白酶进行复配（见表6）。

表6 复合酶添加比例正交试验因素水平表Table 6 Factor levels of orthogonal test of complex enzyme addition ratio

1.3.5 氨基酸态氮含量测定

参照GB 5009.235-2016《食品中氨基酸态氮的测定》，采用自动电位滴定仪测定。

1.3.6 氨基酸测定

参照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》，采用全自动氨基酸分析仪测定。

1.3.7 呈味核苷酸、有机酸含量测定

参照孙达锋等[12]的方法。

1.3.8 滋味贡献评价

采用味觉活性值（TAV）法评价呈味物质对兰茂牛肝菌酶解液滋味的贡献，TAV指样品中各呈味物质的测定值与该物质味道阈值之比[13]，计算见公式（1）。

式中：

C1——滋味化合物的含量，mg/g;

C2——为滋味阈值浓度，mg/g。

1.3.9 等效鲜味浓度分析

Yamaguchi等[14,15]提出用等效鲜味浓度（EUC）来评价食品的呈鲜味作用。EUC值越大，表示食品鲜味越强。计算公式见公式（2）。

式中：

EUC——等效鲜味浓度，g MSG/100 g；

ai——呈鲜氨基酸（谷氨酸或天冬氨酸）的质量，g/100 g；

aj——呈味核苷酸（5'-AMP、5'-IMP、5'-GMP）的质量，g/100 g；

bi——呈鲜氨基酸相对谷氨酸的值（谷氨酸=1.00、天冬氨酸=0.077）；

bj——呈味核苷酸相对5'-IMP的值（5'-IMP=1.00、5'-AMP=0.18、5'-GMP=2.30）；

1 218 ——协同作用常数。

1.4 数据分析

试验数据采用Excel处理，GraphPad prism5做差异性分析及作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶添加量对三种蛋白酶酶解效果的影响

酶添加量过少会导致底物酶解不彻底，氨基酸态氮含量过低，但酶添加过多又会导致底物过度酶解，部分以氮形式存在的氨基酸也有可能被进一步分解，导致氨基酸态氮含量的降低。由图1可知，三种蛋白酶酶解液的氨基酸态氮含量均随着酶添加量的增加呈先上升后下降的趋势，所以选取中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶最适添加量（m/m）分别为0.80%、0.80%、3.70%。

图1 酶添加量对三种蛋白酶酶解液氨基酸态氮含量的影响Fig.1 Effects of enzyme dosage on amino acid nitrogen content of enzymatic hydrolysate

2.1.2 pH值对三种蛋白酶酶解效果的影响

不同的蛋白酶其最适pH值不同，对于不同的酶解底物，其所需pH值也会略有改变。由图2可知，三种蛋白酶酶解液的氨基酸态氮含量随着pH值的升高呈先升高后下降的趋势。因此中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶最适pH值分别为：7.5、6.5、6.5。

图2 pH值对三种蛋白酶酶解液的氨基酸态氮含量的影响Fig.2 Effects of pH values on amino acid nitrogen content of enzymatic hydrolysate

2.1.3 酶解温度对三种蛋白酶酶解效果的影响

酶解温度影响酶的活性及酶催化反应的进程。由图3可知，三种蛋白酶酶解液的氨基酸态氮含量均随着温度的升高呈先上升后降低的趋势。因此，中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶最适温度分别为：50、50、55 ℃。

图3 酶解温度对三种酶酶解液氨基酸态氮含量的影响Fig.3 Effects of temperature on amino acid nitrogen content of enzymatic hydrolysate

2.1.4 酶解时间对三种蛋白酶酶解效果的影响

由图4可知，酶解液中氨基酸态氮的含量随着酶解时间的延长而增加，但到达一定值时，氨基酸态氮含量则随着时间的延长开始减少，这可能是因为酶对底物的酶解是逐渐进行的，需要经过一定时间，但酶解时间过长，会使部分以氮形式存在的氨基酸被水解，导致氨基酸态氮含量进一步降低。因此，中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶选取的最适酶解时间分别为：3.0、3.0、1.5 h。

图4 酶解时间对三种蛋白酶酶解液的氨基酸态氮含量的影响Fig.4 Effects of time on amino acid nitrogen contentof enzymatic hydrolysate

2.2 正交试验结果与分析

2.2.1 单一蛋白酶正交试验优化

由表7可知，中性蛋白酶酶添加量、pH值、温度、时间四个因素对氨基酸态氮含量的影响顺序为时间＞温度＞pH值＞酶添加量，最佳工艺组合为A1B2C2D1，即酶添加量0.70%、pH值7.5、温度50 ℃、酶解时间2.5 h。在该条件下进行验证试验，酶解液氨基酸态氮含量为113.72 mg/100 mL。风味蛋白酶四个因素对氨基酸态氮的影响顺序为pH值＞时间＞温度＞酶添加量，最佳工艺组合为A3B3C1D3，即酶添加量0.90%、pH值7.0、温度48 ℃、时间3.5 h，在该条件下进行验证试验，兰茂牛肝菌酶解液氨基酸态氮含量为115.65 mg/100 mL。木瓜蛋白酶四个因素对氨基酸态氮的影响顺序为pH值＞温度＞酶添加量＞时间，最佳工艺A2B3C2D2，即酶添加量3.70%、pH值7.0、温度55 ℃、时间1.5 h，在该条件下进行木瓜蛋白酶酶解验证试验，兰茂牛肝菌酶解液氨基酸态氮含量为110.48 mg/100 mL。

表7 单一蛋白酶正交试验结果Table 7 Results of single protease orthogonal test

2.2.2 三种酶复配酶解条件优化

由表8可知，pH值、温度、时间三因素对三种复合酶酶解液氨基酸态氮的影响顺序为时间＞温度＞pH值。其最佳工艺组合为A2B2C1，即pH值7.0，温度50 ℃，时间1.5 h。在该条件下进行三种酶复配酶解条件的验证试验，兰茂牛肝菌酶解液氨基酸态氮含量为122.24 mg/100 mL。

表8 三种酶复配条件正交试验结果Table 8 Results of three enzyme compositeconditions orthogonal test

2.2.3 三种酶复配配比正交试验结果

由表9可知，三种酶添加量对氨基酸态氮的影响顺序为中性蛋白酶添加量＞木瓜蛋白酶添加量＞风味蛋白酶添加量。其最佳工艺组合为A1B2C3，即中性蛋白酶添、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶加量（m/m）分别为0.60%、0.90%、4.70%。在该条件下进行三种酶复配酶解条件的验证试验，兰茂牛肝菌酶解液氨基酸态氮含量为124.01 mg/100 mL。

表9 三种蛋白酶复配配比正交试验结果Table 9 Results of three protease compounding ratios orthogonal test

2.3 酶解液滋味分析

2.3.1 酶解液氨基酸分析

游离氨基酸不仅是营养成分，还可以改变食品的风味，是食品的滋味成分[16]，呈现出鲜味、甜味、苦味等。五种酶解液中游离氨基酸组成及含量如表10所示。兰茂牛肝菌酶解液中共检出17种游离氨基酸，鲜味氨基酸含量和游离氨基酸总量均高于郝志林等[17]检测的鸡胸肉样品的游离氨基酸含量，所以兰茂牛肝菌酶解液适合做调味料。且五种酶解液的游离氨基酸中均是谷氨酸含量最高，单一蛋白酶中风味蛋白酶酶解液的总游离氨基酸含量最高（11.50 mg/g），蛋白酶复配后酶解液中总游离氨基酸含量显著高于单一蛋白酶（P＜0.01），因此蛋白酶复配后酶解有利于游离氨基酸的释放。

表10 酶解液游离氨基酸的组成及含量Table 10 Composition and content of amino acids of enzymatic hydrolysate

目前，采用呈味强度值（TAV）法评价单个滋味成分对酶解液滋味的贡献大小，通常认为，当TAV大于1时，该成分对样品呈味有重要影响，并且数值越大，贡献越大[18]。由表13可知，兰茂牛肝菌五种酶解液TAV均大于1的游离氨基酸为谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、精氨酸（Arg），且谷氨酸最高，说明谷氨酸对兰茂牛肝菌酶解液呈味贡献最大。

2.3.2 酶解液呈味核苷酸分析

核苷酸是产生鲜味的重要物质，与游离氨基酸、无机盐等具有协同作用，能够使鲜味增强[19]。五种酶解液中呈味核苷酸组成及含量见表11。木瓜蛋白酶酶解液的呈味核苷酸含量最高，主要是因为5'-CMP含量和5'-AMP较高，这与庄金达[20]的研究结果一致。5'-AMP可以使食用菌呈现甜味并抑制苦味[21]。由表13可知，呈味核苷酸TAV均小于1，所以单独呈味核苷酸对兰茂牛肝菌酶解液滋味影响不大，主要起协同作用。

表11 酶解液呈味核苷酸组成及含量Table 11 Composition and content of flavor nucleotides of enzymatic hydrolysate

2.3.3 酶解液有机酸分析

食用菌有机酸与酯类、氨基酸、芳香物质的代谢有关[20]，其种类和含量影响食用菌独特的风味。五种酶解液中有机酸种类和含量见表12。兰茂牛肝菌酶解液中苹果酸含量最高，乙酸次之，二者占复合蛋白酶酶解液有机酸总量的50%以上，这与庄金达、谷镇等[20,22]的研究一致。由表13可知，酒石酸、苹果酸、乙酸TAV均大于1，且酒石酸TAV在9.50～33.25之间。所以酒石酸、苹果酸、乙酸对兰茂牛肝菌酶解液的风味有贡献，且酒石酸贡献最大。

表12 酶解液有机酸组成及含量Table 12 Composition and content of organic acids in of enzymatic hydrolysate

表13 酶解液游离氨基酸、呈味核苷酸、有机酸TAV分析Table 13 TAV analysis of free amino acids, flavoring nucleotides and organic acids in of enzymatic hydrolysate

2.3.4 酶解液EUC值计算结果

由图5可以看出，复配配比正交优化的酶解液EUC值最高，但与复配条件正交优化和中性蛋白酶酶解液的EUC值没有显著差异（P＞0.05）。

图5 酶解液等效鲜味浓度值EUCFig.5 EUC values of enzymatic hydrolysate

3 结论

本研究采用单因素和正交试验优化兰茂牛肝菌酶解液制备工艺，获得的最优酶解条件为：pH值7.0，温度50 ℃，时间1.5 h，中性蛋白酶添加量为0.60%、风味蛋白酶添加量为0.90%、木瓜蛋白酶添加量为4.70%，此条件下获得的酶解液的氨基酸态氮为124.01 mg/100 mL、游离氨基酸总量为12.33 mg/g、呈味核苷酸总量为96.48 μg/g、有机酸总量为4 511.59 μg/g，EUC值为2.46 g MSG/100 g，均高于单一蛋白酶酶解液。谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、精氨酸（Arg）对兰茂牛肝菌酶解液呈味有直接贡献，且谷氨酸贡献最大；呈味核苷酸对酶解液呈味无直接贡献；酒石酸是酶解液中对呈味贡献最大的有机酸。本研究为酶解法制备食用菌调味精基料提供了理论基础，丰富产品类型，满足了人们的需求，提高产品附加值。