丝瓜皮多酚的提取及抗氧化性研究

刘晓倩，陈佳宇，任文静，郭 然，彭 琪，丁建英

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

丝瓜（Luffa aegyptiacaMiller）属于葫芦科的攀援草本植物[1]，别名为胜瓜、菜瓜，含有蛋白质、脂质、碳水化合物、铁、钙、磷、维生素B1及抗坏血酸等多种营养成分[2-3]。丝瓜皮可以作为中药，具有清热解毒、消炎、抗氧化、提高免疫力等功效[4,5]。相关研究显示，丝瓜中含有多酚类物质[6]，主要由类黄酮类和酚酸类成分组成[7]；丝瓜皮中的多酚含量高于丝瓜果肉，其醇提物中总多酚含量为9.8 mg/g。而丝瓜皮作为丝瓜食用时的副产物常被当作废弃物丢弃，利用率极低[4-5]，因此对丝瓜皮功能成分的提取及研究，可为丝瓜皮资源的开发利用提供基础。

超声辅助提取方法与传统提取方法相比，利用其热作用和机械作用，可以促使功能成分的溶出，因此可以缩短时间、提高得率[8]，用于多种功能成分的提取[4,9]，本文用超声辅助提取方法提取丝瓜皮中的多酚，通过研究不同的提取温度、时间、乙醇浓度和料液比对多酚提取率的影响，利用单因素结合响应面法对多酚提取工艺进行优化，确定最优的提取工艺，同时研究其抗氧化性，以期为丝瓜皮的开发利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

新鲜寿光丝瓜购于常熟大润发超市。

没食子酸，上海源叶生物技术有限公司；福林酚试剂、无水乙醇、无水碳酸钠、1,1- 二苯基-2- 苦基肼自由基（DPPH）、抗坏血酸（VC）、水杨酸、硫酸亚铁，国药集团化学试剂有限公司；30%过氧化氢溶液，强盛功能化学股份有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

RE-5205A 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器公司；SHZ-D（III）循环水式真空泵，上海力辰邦西仪器科技有限公司；TU-1901 双光束紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；KH-100DB 超声波清洗机，昆山禾创超声仪器有限公司；HH-4 数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；TG16-WS 高速台式离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 丝瓜皮多酚提取

丝瓜皮处理：将新鲜的丝瓜刮皮，刮下的丝瓜皮于阴凉处干燥24 h，再将丝瓜皮于60 ℃干燥至恒质量，磨成粉末，过60 目筛，置于4 ℃冰箱备用。

丝瓜皮多酚提取：称取4 g 丝瓜皮粉末，倒入锥形瓶中，同时以不同料液比加入一定浓度的乙醇溶液，振荡混匀，使丝瓜皮粉末与乙醇溶液充分混合，超声功率为100 W，连续超声提取一定时间，4 000 r/min 离心5 min，将上清液转入旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩成原体积的1/4，得到丝瓜皮多酚浓缩液，备用。

1.3.2 单因素试验

丝瓜皮超声辅助法提取时，结合预试验，将超声提取的温度、时间、乙醇浓度和料液比四个因素进行单因素试验，提取温度为20、30、40、50、60、70 ℃，提取时间为10、20、30、40、50、60 min，乙醇浓度为60%、65%、70%、75%、80%、85%，料液比（质量体积比）为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），依次比较不同因素下各水平对丝瓜皮多酚得率的影响，以期获得超声辅助提取丝瓜皮多酚的最佳水平[10]。

1.3.3 丝瓜皮多酚提取的响应面优化试验

为进一步研究各因素的交互作用对多酚提取率的影响，采用响应面分析法优化提取工艺[11]。基于Box-Behnken 试验设计，选择对多酚提取率有影响的4 个主要因素乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度进行4 因素3 水平响应面分析试验，响应面设计水平见表1[12]。

表1 响应面设计因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface design

1.3.4 丝瓜皮多酚得率的测定

将1.3.1 得到的丝瓜皮多酚浓缩液5.0 mL加入25.0 mL容量瓶中，加水定容，取0.5 mL 置入50 mL 比色皿中，随后向比色皿中加入1.0 mL 福林酚试剂，振荡，使溶液充分混匀，再加入2.0 mL 10%碳酸钠溶液，振荡，静置1 h。最后测定溶液在760 nm 下的吸光度，根据公式（1）计算丝瓜皮多酚得率[13]。

式中，Y为丝瓜皮的多酚得率，mg/g；m为丝瓜皮质量，g；n 为稀释倍数；V为被测液体积，mL；c为多酚浓度，mg/mL。

1.3.5 丝瓜皮多酚对DPPH 自由基的清除作用

在试管中分别滴加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的提取液2 mL，再加入2.0 mL、0.2 mmol/L 的DPPH 溶液，充分震荡，避光静置30 min。以无水乙醇调零，在517 nm 波长下测得吸光度值；把DPPH 溶液换为无水乙醇，作为对照测其吸光度值；取相同体积DPPH 溶液和无水乙醇混合，测其吸光度值。按照上述步骤，将抗坏血酸作为参照物[14]，测定其吸光度值。以上述操作平行3 次，取平均值。用公式（2）计算多酚对DPPH 自由基的清除率。

式中，A样品为提取液和DPPH 溶液的吸光度值；A对照为提取液和无水乙醇的吸光度值；A空白为无水乙醇和DPPH 溶液的吸光度值。

1.3.6 丝瓜皮多酚对羟基自由基的清除作用

在试管中分别滴加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 提取液2 mL，再加入9 mmol/L FeSO4溶液和8.8 mmol/L H2O2溶液各2.0 mL，充分震荡，静置5 min 再加入9 mmol/L 水杨酸溶液2.0 mL，充分震荡，放置于水浴锅中37 ℃恒温水浴30 min。以蒸馏水调零，在510 nm 波长下测得吸光度值；把过氧化氢溶液换为蒸馏水，作为对照测其吸光度值；将提取液替换成蒸馏水作为空白对照，测其吸光度值[15]。按照上述步骤，将抗坏血酸作为参照物，测定其吸光度值。以上述操作平行3 次，取平均值。根据公式（3）计算丝瓜皮多酚对羟基自由基的清除率。

式中，A样品为提取液和H2O2溶液的吸光度值；A对照为提取液和蒸馏水的吸光度值；A空白为蒸馏水和H2O2溶液的吸光度值。

1.4 数据处理方法

使用Excel 2010 进行数据处理及作图。

2 结果与分析

2.1 丝瓜皮多酚提取单因素试验结果

2.1.1 料液比对丝瓜皮多酚得率的影响

由图1 可知，随着丝瓜皮多酚提取体系中溶剂量的增加，丝瓜皮多酚的得率呈现先升高后下降的趋势，这可能是由于溶剂的增加，使丝瓜皮多酚与溶剂中多酚浓度差增大，促进多酚的溶出。但当料液比超过1∶15 后，随着溶剂量的不断增加，多酚在浓缩后处理过程中损失增加[14-15]，使提取率下降。由此将料液比设定为1∶10～1∶20，作为后续响应面优化试验的条件。

图1 料液比对丝瓜皮多酚得率的影响Fig.1 Effect of material liquid ratio on the yield of polyphenols from luffa peels

2.1.2 乙醇浓度对丝瓜皮多酚得率的影响

如图2所示，随着乙醇浓度的增加，丝瓜皮多酚出现先增后减的趋势。当乙醇浓度为60%～75%时，丝瓜皮多酚提取率呈明显上升趋势，在75%时达到最大值，这可能是由于乙醇浓度过低时，极性过强，导致糖类等水溶性物质浸出量增大；但在乙醇浓度为75%～85%时，得率逐渐降低，可能是乙醇浓度过高造成提取溶剂极性太低，导致蛋白质发生变性，使细胞壁结构变得致密，从而导致多酚不能溶出；另外多酚往往以氢键形式与其他成分结合，乙醇浓度过高，直接影响氢键的断裂，使多酚提取得率下降[16]。因此，将乙醇浓度设定为70%～80%作为响应面优化试验的条件。

图2 乙醇浓度对丝瓜皮多酚得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on polyphenol yield rate of luffa peels

2.1.3 提取时间对丝瓜皮多酚得率的影响

如图3所示，当提取时间为10～30 min 时，丝瓜皮多酚得率随提取时间增加而增加；当达到30 min 时，多酚得率达到最大值，为7.50 mg/g；提取时间达到30 min以后，多酚得率随提取时间的增加而下降。可能的原因是多酚溶解于溶剂内需要时间，所以在30 min 之前，多酚得率呈上升趋势；当达到30 min 临界点时，多酚得率将不再增长，而且随着提取时间延长，提取液中的多酚物质会发生氧化、聚合、分解等各种反应[17]，从而使其含量有所下降。由此将提取时间设定为20～40 min 作为响应面优化试验的条件。

图3 提取时间对丝瓜皮多酚得率的影响Fig.3 Effects of extraction time on the polyphenol yield rate of luffa peels

2.1.4 提取温度对丝瓜皮多酚得率的影响

如图4所示，当提取温度在20～60 ℃时，丝瓜皮多酚得率随提取温度的升高而上升，当提取温度达到60 ℃时，达到最大值，为6.08 mg/g。这是因为随着提取温度的升高，分子运动加剧，从而使多酚析出增加；但温度超过60 ℃，过高的温度使多酚的化学结构破坏，从而使多酚得率下降[17]。由此将提取时间设定为50～70 ℃作为响应面优化试验的条件。

图4 提取温度对丝瓜皮多酚得率的影响Fig.4 Influence of extraction temperature on polyphenol yield rate of luffa peels

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验结果及方差分析

响应面试验结果如表2（见下页）所示，利用软件Design- Expert 10.0.3 对数据进行解析[18]，得到二次多项回归方程：多酚提取率Y（%）=9.96+0.96A+0.87B+0.26C+109D+0 .37AB-0 .24AC+0 .30AD+0 .28BC-0.62BD+0.045CD-3.24A2-1.86B2-0.85C2-1.64D2。

表2 试验设计与结果Table 2 Test design and results

对模型进行回归分析，其结果见表3，一次项A、B、C、D 对多酚提取率线性效应显著（P＜0.05），二次项A、B、C、D 对多酚提取率曲面效应显著（P＜0.05），AB、AD、BD 对多酚提取率交互效应显著（P＜0.05）。该模型的负相关系数R2=0.991 8，P＜0.000 1，可以证明该模型达到极显著水平，该模型失拟项不显著（P＞0.05），证明该模型可信，拟合度较高，可用于丝瓜皮超声波辅助提取工艺的分析和优化。由F值可知，各因素对丝瓜皮多酚提取量的影响大小顺序为提取温度＞乙醇浓度＞提取时间＞料液比。

2.2.2 因素间交互作用分析结果

由图5（见53 页）结合表3（见54 页）可知，提取时间-乙醇浓度、乙醇浓度-提取温度、乙醇浓度-料液比交互作用对丝瓜皮多酚提取率影响显著（P＜0.05），其他因素交互作用对丝瓜皮多酚提取率影响不显著。

图5 各因素的交互作用对多酚提取率的影响Fig.5 The influence of the interaction of various factors on the extraction rate of polyphenols

表3 丝瓜皮多酚提取率拟合回归方程的方差分析结果Table 3 Variance analysis results of the Prate fit regression equation

2.2.3 最优工艺条件试验验证

多酚最优提取工艺为乙醇浓度76.02%、提取时间30.19 min、料液比1∶15.75（g/mL）、提取温度62.62 ℃，在此条件下模型预测的多酚提取率为10.24 mg/g。

根据软件预测结果，结合实际工艺设置的可行性，取乙醇浓度76%、提取时间30 min、料液比1∶16（g/mL）、提取温度63 ℃为条件进行三次重复试验，平均多酚提取率为10.13 mg/g，与模型预测结果接近，表明模型拟合效果良好，基于该响应面模型分析优化多酚提取率提取工艺的方法有效可行[19]。

2.3 丝瓜皮多酚溶液的抗氧化能力分析结果

2.3.1 丝瓜皮多酚对DPPH 自由基的清除效果

酚类化合物是果蔬中主要的抗氧化物质之一，DPPH自由基被广泛应用于天然植物或化合物的抗氧化能力评价。如图6（见53页）所示，丝瓜皮多酚与VC在消除DPPH自由基方面效果相近，其清除率随溶液浓度的增加而增加，呈现正相关。当丝瓜皮多酚浓度为0.6 mg/mL 时，对DPPH 自由基的清除率为92.8%，显示丝瓜皮多酚对DPPH 自由基具有良好的清除效果。有研究表明胎菊多酚对DPPH 自由基的清除率为97.49%[20]，与丝瓜皮多酚相当。

图6 丝瓜皮多酚对DPPH 清除效果Fig.6 Effect of luffa peels on the effect of DPPH removal

2.3.2 丝瓜皮多酚对羟基自由基的清除效果

丝瓜皮多酚溶液与VC 溶液对羟基自由基清除效果如图7所示，VC 与丝瓜皮多酚对羟基自由基具有清除效果，但通过数据对比发现，丝瓜皮多酚对羟基自由基的清除效果超过VC 对羟基自由基的效果。当丝瓜皮多酚浓度为0.6 mg/mL 时，对羟基自由基的清除率为88.17%。远高于邵安冉等[20]报道的胎菊多酚26.42%的羟基自由基清除率，可见丝瓜皮多酚对羟基自由基具有较好的清除效果。

图7 丝瓜皮多酚对羟基自由基清除效果Fig.7 Effect of luffa peels polyphenols on hydroxyfree radicals removal

3 结论

在构建资源节约型社会的进程中，农业生物废弃物的再利用越来越受到人们的重视。本文以丝瓜食用后丢弃的丝瓜皮作为原料，采用超声辅助乙醇提取的方法对丝瓜皮中的多酚进行提取，优化提取工艺参数，并对丝瓜皮多酚的抗氧化性进行了研究。得出丝瓜皮多酚超声辅助提取的最佳工艺条件为乙醇浓度76%、提取时间30 min、料液比1∶16（g/mL）、提取温度63 ℃。以此条件进行验证实验，得到丝瓜皮多酚得率为10.13 mg/g，与响应面模型预测值10.24 mg/g 相近。丝瓜皮多酚抗氧化性能研究发现，随着丝瓜皮多酚浓度增大，丝瓜皮多酚对DPPH 和羟基自由基的清除率均不断增加，丝瓜皮多酚浓度达到0.6 mg/mL 时，对DPPH 和羟基自由基的清除率分别为92.8%和88.17%，说明丝瓜皮多酚具有良好的抗氧化活性。丝瓜皮作为丝瓜烹饪或加工时产生的废弃物，但其含有丰富的多酚成分，丝瓜皮多酚具有良好的抗氧化性，在食品加工以及化妆品行业有广阔的应用前景，后续将对丝瓜皮多酚进一步纯化并对其组分研究，为其进一步应用提供基础。