超声波辅助酶解法提取文冠果籽粕蛋白工艺优化及抗氧化活性研究

宋健平，郭欣奕，刘欣雨，路 昌，王雨萌，王 磊，于 梅*

（1.山东农业工程学院食品科学与工程学院，山东 济南 250100；2.山东省林草种质资源中心暖温带林草种质资源保存与利用国家林业和草原局重点实验室，山东 济南 250102）

文冠果（Xanthoceras sorbifoliumBunge）是无患子科文冠果属落叶灌木或小乔木,是我国北方特有的珍稀木本油料植物[1]，种仁可以榨油，制得的文冠果油是高档食用油，具有抗炎、清除自由基、抗肿瘤活性和修复脑神经等功能[2]。文冠果籽粕是文冠果种仁加工制油后得到的副产物，含有丰富的蛋白质，研究发现其营养价值和消化吸收率高于大豆蛋白和葵花蛋白，接近于酪蛋白，是一种利用率较高的优质蛋白，具有良好的开发利用价值[3]。但目前文冠果籽粕利用率不高，主要用于饲料或直接丢弃，潜在价值尚未得到充分开发，综合利用水平和经济效益低下。文冠果籽粕高值化深加工和综合性研究对于缓解文冠果资源浪费、增加产品附加值具有重要意义[4]。

现已有较多研究发现，植物蛋白质酶解后的产物具有降低胆固醇和血脂、抗疲劳、抗氧化等功能活性[5-7]。植物源蛋白酶解物的制备方法主要有酶解法、化学合成法、微生物发酵法和直接提取法[8]，但是采用以上方法进行酶解反应所需的酶解时间较长，酶解效率较低，对酶解产物的抗氧化活性有一定影响[9]。为了优化蛋白质酶解进程及提高酶解产物的抗氧化性能，超声波在抗氧化酶解制备中的应用引起了广泛关注与研究[10-13]。超声波是近年来兴起的绿色环保的聚合物降解方法[14-16]，且利用超声波协同作用在其他物质的提取方面效果显著[17]。

迄今为止，文冠果籽粕蛋白的提取方法和相关研究鲜有报道，未见超声波技术应用于文冠果籽粕的研究。赵晨煊等[18]采用改良Osborne 法分级分离文冠果油粕中的醇溶蛋白、谷蛋白、球蛋白和清蛋白，并用木瓜蛋白酶分解，并从4 个酶解产物中分离出活性肽，通过测定它们对DPPH 和ABTS 自由基的清除能力来评价其抗氧化活性。陈江魁等[3]对文冠果多肽水解条件进行了优化，并测定酶解液的水解度、对DPPH 和ABTS 自由基的清除能力，结果较好。本研究以文冠果籽粕为原料，利用超声波辅助酶解技术得到文冠果籽粕酶解液，在单因素试验的基础上，采用响应面试验优化酶解工艺，并通过自由基清除试验对其抗氧化活性进行研究，为进一步扩大文冠果的开发利用范围提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

文冠果籽粕，山东林昱宏生物科技有限公司；Arazyme 高效蛋白酶（5 000 U/mg），中韩食品研究所提供；Tris-HCl 缓冲液、邻苯三酚、二硫苏糖醇（DTT）、2,2-联氮-二(3- 乙基-苯并噻唑-6- 磺酸) 二铵盐（ABTS）、1,1- 二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海源叶生物技术有限公司；过硫酸钾、茚三酮（Ninhydrin），上海麦克林生化科技有限公司；七水合硫酸亚铁、邻二氮菲、正己烷等，国药集团化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 主要设备

WZJ-6J 振动式超细粉碎机，济南倍力粉技术工程有限公司；BK-600B 型超声清洗仪，济南巴客超声波科技有限公司；TGL-20M高速台式离心机：湘仪离心机仪器有限公司；FD-1D-80 冷冻干燥机，美国西蒙公司；TU-1810 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 文冠果酶解液的制备

选取文冠果籽粕为原料，文冠果籽粕与正己烷按照1∶3（g/mL）进行脱脂处理，用振动式超细破碎机超微粉碎籽粕得到文冠果籽粕粉，过300 目筛。利用超声清洗仪在温度37 ℃、超声波功率300 W，超声时间20 min，选用Arazyme 高效蛋白酶在料液比1∶12（g/mL）、高效蛋白酶添加量0.15%、酶解温度37 ℃，酶解时间6 h 和pH 8.5条件下对文冠果籽粕粉进行酶解。酶解结束后迅速置于80 ℃水浴中加热15 min 进行灭酶得到酶解液，酶解液进行超滤，截留分子量小于3 kDa 的组分，经-80 ℃冷冻干燥后得到酶解物，配置成不同浓度（2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5mg/mL）的文冠果籽粕酶解液。

1.3.2 单因素试验

以不同的超声时间（10、15、20、25、30 min），酶添加量（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%），超声功率（100、200、300、400、500 W）进行单因素试验，考察不同因素对文冠果籽粕酶解液水解度的影响。

1.3.3 响应面试验设计

根据响应面分析法中Box-Benhnken 的中心组合试验设计，以超声时间、酶添加量、超声功率为试验因素，以水解度为响应值，设计响应面试验，试验因素水平设计见表1。

1.4 蛋白质水解度（Degree of hydrolysis，DH）测定方法

采用茚三酮比色法测定[19]。取1 mL 标准溶液于比色管中，再依次加入1 mL 缓冲液、1 mL 茚三酮溶液、2 mL蒸馏水，封好摇匀后放入沸水浴中加热15 min，取出放至冷水中冷却15min。结束后，向每支比色管中分别加入5mL碘酸钾溶液摇匀，于波长568 nm 处测定吸光度。水解度按照公式（1）计算得出。

式中，h为未加酶的酶解液的水解度；htot为1 g 文冠果籽粕中的肽键摩尔数（氨基酸分析仪测定）。

1.5 抗氧化活性研究

1.5.1 羟基自由基清除能力的测定

参照宗玉霞[20]的方法进行测定。

1.5.2 超氧阴离子自由基清除能力的测定

参照徐锁玉等[21]的研究方法。

1.5.3 DPPH 自由基清除能力的测定

参照程蕾等[22]的研究方法进行测定。

1.5.4 ABTS 自由基清除能力的测定

参照李奕葶等[23]的研究方法进行测定。

1.6 数据处理

采用Origin Pro 2021、Design-Expert 13、IBM SPSS Statistics 26、GraphPad Prism 9.5 和Excel 2010 软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 酶解条件单因素试验结果

2.1.1 超声时间对蛋白质水解度的影响

如图1所示，随着超声时间不断增加，蛋白质的水解度不断升高，当超声波时间超过20 min 后，蛋白质的水解度逐渐下降。可能是因为超声波的机械和空切等作用，使文冠果蛋白质的结构逐渐被破坏，更多的酶结合位点暴露出来，但是当超声波时间过长，结合位点和酶的结构也会被逐渐破坏，底物浓度不断减少，而产物浓度逐渐增高，导致两者之间逐渐处于不平衡状态，从而影响蛋白质水解。因此选择最佳超声时间为20min。

图1 超声时间对蛋白质水解度的影响Fig.1 Influence of ultrasonic duration on protein hydrolysis degree

2.1.2 酶添加量对蛋白质水解度的影响

如图2所示，随着酶添加量的增加，蛋白质水解度呈现先上升后下降最后逐渐趋于稳定的趋势。当酶添加量为0.05%时，酶含量过低，无法完全酶解文冠果籽粕粉，随着酶添加量的增加，蛋白质水解度也不断增大，在酶添加量达到0.15%时，水解最彻底；酶添加量超过0.15%，水解度反而逐渐降低趋于平稳，这是因为底物与酶反应达到饱和状态，多余的高效蛋白酶无法发挥其作用。因此，最适酶添加量为0.15%。

图2 酶添加量对蛋白质水解度的影响Fig.2 Influence of enzyme addition on protein hydrolysis degree

2.1.3 超声功率对蛋白质水解度的影响

如图3所示，随着超声功率的不断增加，蛋白质的水解度也不断升高，当超声功率超过300 W 后蛋白质的水解度开始下降。主要原因是随着超声功率的加大，增大了超声波的空化及机械搅拌作用，增加了液体流动性，蛋白酶能更好地与底物接触，促进酶解物的溶出，利于提高提取率，但随着超声功率的增加，容易造成内部环境局部过热，使酶无法与底物充分接触，从而降低蛋白质的水解度。因此，最佳超声功率为300 W。

图3 超声功率对蛋白质水解度的影响Fig.3 Influence of ultrasonic power on protein hydrolysis degree

2.2 酶解条件响应面试验结果分析

2.2.1 回归模型的建立及其显著性检验

综合单因素试验结果，并由IBMSPSS Statistics 26 软件进行分析可得，超声时间、酶添加量和超声功率对水解度影响均显著（P＜0.05），因此以水解度为响应值，分析超声时间、酶添加量、超声功率对响应值的影响，设计3因素3 水平共17 个试验点的响应面试验，试验结果如表2所示。

表2 酶解条件响应面试验设计及结果Table 2 Response surface experimental design and results of enzymatic hydrolysis conditions

根据响应面试验设计测得的结果，使用Design-Expert 13 软件对试验数据进行多项式回归拟合，并进一步研究和优化影响稳定系数的因素，做响应面图。多元回归拟合得到稳定系数与各因素的二次方程模型为Y=22.30-0.087 5A-0.125 0B-0.137 5C+0.025 0AC-0.050 0BC-1.74A2-1.81B2-3.54C2。

由表3 方差分析结果表明，模型F值为404.10，建立的回归模型对水解度达显著水平（P＜0.01），表明该回归方程模型显著，说明了方程有意义；方程失拟项P=0.60差异性均不显著（P＞0.05），说明回归方程对实验的拟合情况误差不大，能很好地表现出各影响因素和响应值之间的联系，并能够较好地预测实验值。模型判定系数R2=0.987 5，表明试验值与预测值有很好的相关性；R2Adj=0.995 6，表明模型可以解释99.56%的响应值变化。说明该模型可用于分析和预测超声波辅助酶解文冠果籽粕的水解度。其中，C 对文冠果籽粕酶解液水解度有显著影响（P＜0.05），A2、B2、C2影响极显著（P＜0.01），其他影响不显著，3 个因素对水解度影响大小依次为超声功率、酶添加量、超声时间。

表3 回归模型水解度方差分析Table 3 Variance analysis of regression model hydrolysis degree

2.2.2 酶解条件响应面试验交互作用结果分析

由图4 可直观看出各因素对文冠果籽粕酶解液水解度的影响，其中C 的影响较显著，表现为曲线相对较陡，对文冠果籽粕的水解度影响较大，A、B 的影响较不显著，表现为曲线比较平滑对文冠果籽粕的水解度影响较小，这与回归方程的方差分析结果一致。

图4 因素的交互作用对文冠果籽粕酶解液水解度的影响Fig.4 The influence of the interaction of factors on the hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate of X.sorbifolia Bunge seed meal hydrolysate

2.2.3 最佳酶解条件及验证试验

模型预测得到最佳酶解条件为超声时间18.99 min，酶添加量0.14%，超声功率309.09 W，此时的水解度为22.30%。考虑到实际可操作性，将最佳酶解条件调整为超声时间20 min、酶添加量0.15%、超声功率300 W，在此条件下，经3 次验证试验，实际得到水解度为22.57%，与理论值相接近，表明采用响应面分析法得到的优化条件是可靠的。

2.3 水解法与超声波辅助酶解法效果比较

将酶解文冠果籽粕的两种方法——水酶法与超声波辅助酶解法进行比较，结果见表4。利用超声波辅助酶解法酶解的文冠果籽粕的水解度比水酶法增加了9.36%。利用超声波辅助酶解蛋白质制备酶解液，可以大大提高酶解效率。

表4 两种酶解方法比较Table 4 Comparison of two enzymatic hydrolysis methods

2.4 文冠果籽粕酶解液抗氧化活性结果分析

2.4.1 文冠果籽粕酶解液对羟基自由基的清除率

由图5 可知，随着酶解液中酶解物质量浓度的升高，文冠果籽粕酶解液对羟基自由基清除率先升高后趋于平稳，但始终弱于同浓度下的VC。当文冠果籽粕酶解液质量浓度为17.5 mg/mL 时，其对羟基自由基清除率为（65.35±0.41）%，IC50值为6.39 mg/mL。虽与同质量浓度的VC 相比仍具有一定的差距，但也能表现出一定的羟基自由基清除能力。

图5 羟基自由基清除能力的测定Fig.5 Determination of hydroxyl radical scavenging capacity

2.4.2 文冠果籽粕酶解液对超氧阴离子自由基的清除率

由图6 可知，文冠果籽粕酶解液具有清除超氧阴离子自由基的能力。在2.5～17.5 mg/mL 的质量浓度范围内，清除率与酶解液浓度呈剂量依赖关系，随着酶解物质量浓度的升高，对超氧阴离子自由基的清除率显著增强。当文冠果酶解液中酶解物的质量浓度为17.5 mg/mL 时，对超氧阴离子自由基清除率为（90.90±0.78）%，对超氧阴离子自由基的IC50值为10.66 mg/mL，同浓度下VC 的清除率为（99.10±0.25）%，在相同质量浓度下超氧阴离子自由基清除率与VC 的作用效果相当。说明文冠果酶解液中酶解物在一定浓度下有较强的超氧阴离子自由基清除能力。

图6 超氧阴离子自由基清除能力的测定Fig.6 Determination of the ability of superoxide anionic free radicals to scavenge

2.4.3 文冠果籽粕酶解液对DPPH 自由基的清除率

由图7 可知，文冠果籽粕酶解液对DPPH 自由基存在清除效果，文冠果籽粕酶解液的DPPH 自由基清除能力随着浓度升高而增大。浓度在2.5～7.5 mg/mL 时，增大趋势较为明显，在7.5～17.5 mg/mL 时趋势趋于平缓，当文冠果酶解液中酶解物质量浓度为17.5 mg/mL 时，对DPPH 清除率为（90.65±0.53）%，IC50值为14.36 mg/mL，同种质量浓度下VC 的清除率为（99.17±0.97）%，与VC的作用效果基本一致。说明文冠果酶解液中的酶解物具有较强的DPPH 自由基清除作用。

图7 DPPH 自由基清除能力的测定Fig.7 Determination of ABTS free radical scavenging capacity

2.4.4 文冠果籽粕酶解液对ABTS 自由基的清除率

由图8 可知，VC 对照组对ABTS 的清除率较高，均达到了95%以上；文冠果籽粕酶解液对ABTS 的清除率远低于VC。但随着文冠果酶解物质量浓度的增加，对ABTS 自由基的清除率的增大趋势较为显著，表现出良好的剂量-效应关系。当文冠果籽粕酶解液浓度达到17.5 mg/mL 时，对ABTS 自由基清除率可达（86.90±0.88）%，IC50值为5.21 mg/mL，与VC 的清除水平相当，说明文冠果籽粕酶解液也具有较强的ABTS 清除能力。

图8 ABTS 自由基清除能力的测定Fig.8 Determination of DPPH free radical scavenging capacity

3 结论

以文冠果籽粕为原料，选用碱性蛋白酶，采用超声波辅助酶解技术制备文冠果籽粕酶解液。通过单因素试验以及三因素三水平的响应面试验，在料液比1∶12，酶解时间6 h，温度37 ℃，酶解pH 8.5 的条件下，得到酶解液的最佳酶解条件是超声时间20 min，酶添加量0.15%，超声功率300 W，在此条件下得到的水解度为22.57%，与水酶法相比，增加了9.36%。通过响应面试验的方差分析得出，超声功率是影响文冠果籽粕酶解工艺的主要因素，然后依次是酶添加量和超声波时间。

自由基清除实验表明，文冠果酶解液中酶解物对羟基自由基、超氧阴离子自由基、ABTS 自由基、DPPH 自由基均有很好的清除能力，且清除能力随酶解物的质量浓度的增大而增大，酶解液在四种体系中的IC50值分别是6.39、10.66、14.36、5.21 mg/mL，说明文冠果酶解液中酶解物的抗氧化活性较明显。试验结果为文冠果副产物的再利用提供理论基础，为文冠果产品的精细加工、合理开发提供理论依据。