农作物秸秆瘤胃内降解的时空程序性及其饲料效率提升技术

■ 成艳芬 胡光辉

（南京农业大学动物消化道营养国际联合研究中心消化道微生物实验室，江苏南京 210095）

秸秆是地球上第一大可再生资源，是公认的第四大能源，其地位仅次于石油、煤炭和天然气[1]，根据联合国粮农组织年鉴，2020 年世界主要粮食产量为93.15 亿吨，与2000年相比增加了52%，甘蔗、小麦、水稻、玉米等占全球基础作物产量的50%左右，粮食的增产意味着秸秆产量的增加，2017年世界秸秆产量已经超过50亿吨[2]，其中相当一部分秸秆会被农民以燃烧的方式清除，但这会造成资源浪费以及当地空气质量的破坏。2022年我国秸秆理论产量为8.40亿吨，其中稻秸为2.08亿吨，麦秸为1.61亿吨，玉米秸为2.88亿吨，3种主要秸秆占总体的78.32%，据报道，我国每年仍然有1 亿吨的秸秆被浪费，造成环境的污染和资源的浪费[3]，同时我国的饲料用粮已经占到粮食总产量的40%左右，2023 年1—5 月我国饲料进出口贸易额见图1，前5 个月，我国饲料进出口均出现贸易逆差，最大贸易逆差为5.17亿美元，总贸易逆差为21.27亿美元，饲料进出口与去年同期相比，出现小幅增加与降低，这反映着我国饲料的短缺困境，因此秸秆的饲料化是解决秸秆焚烧造成环境污染以及我国饲料短缺问题的重要方案。

图1 2023年前5个月我国饲料进出口贸易额及与去年同期相比的增减百分比

虽然农作物秸秆饲料化存在诸多益处，但实施过程中仍然存在需要克服的困难，主要包括：①消化利用率低。植物纤维最内层为纤维素晶体，外面包裹着厚实的半纤维素层，木质素与半纤维素之间相互缠绕连接，因此整个植物细胞壁呈现紧密的网状结构，这种结构阻碍了反刍动物瘤胃水解酶与纤维素和半纤维素接触，降低了纤维多糖的利用效率[4]。②甲烷排放量高。饲粮中的结构性碳水化合物（纤维素和半纤维素）发酵产生乙酸和丁酸，而非结构性碳水化合物（淀粉）与之相反，其发酵更容易产生丙酸，且前者产生甲烷的速率是后者的2～4 倍，因此直接饲喂未经处理的秸秆会导致瘤胃发酵趋向于乙酸发酵而产生更多的甲烷[5]。了解秸秆饲料在瘤胃中的降解特性及当前提高秸秆消化利用率的处理方案，能够给解决提高农作物秸秆饲料化效率中存在的问题带来一些参考。

1 农作物秸秆在瘤胃内降解的时空程序性

反刍动物在采食饲料后，经过牙齿的研磨，搅拌，混合唾液后，形成多水的食糜，通过消化管壁的研磨搅拌后，运送到消化道的下一个部位，与单胃动物所依赖的酶消化不同的是，反刍动物更依赖于瘤胃中的微生物对饲料的消化，是其能够大量利用粗饲料并产生甲烷的重要原因。饲料在瘤胃中的降解分为3 个阶段，甲烷产生也主要分为3条途径。

1.1 瘤胃中饲料秸秆的降解程序

参考汪营[6]的研究，农作物秸秆在反刍动物消化道中的降解过程主要分为3 个阶段，图2 为3 个阶段的模式图。

图2 农作物秸秆在反刍动物消化道内的降解模式

第一阶段为0.5～6.0 h，此阶段秸秆中可溶性物质发生降解，干物质降解速率较低，饲料粗纤维、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）降解较少，乙酸和丙酸少量增加，松散连接菌群数量显著低于紧密连接菌群数量，松散连接α多样性在任何时间段均无显著变化，紧密连接α多样性在此时间段内显著高于其他时间段，松散连接24.0 h 时拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度显著低于其他时间点，紧密连接拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度变化不显著。

第二阶段为6.0～24.0 h，此阶段干物质、粗纤维、NDF 和ADF 降解速率最高，挥发性脂肪酸（VFAs）快速积累，松散连接菌群数量显著低于紧密连接菌群数量，此阶段紧密连接菌群α多样性逐渐降低，且主成分分析表明此阶段紧密连接微生物群落组成正在发生改变，在门水平上厚壁菌门和拟杆菌门数量发生明显降低，此阶段紧密连接菌群中未分类属的相对丰度出现一个明显的增加，而已知的优势属丰度出现明显的降低，这表明此阶段未分类菌属在纤维降解上发挥了主要的作用。

第三阶段为24.0～48.0 h，此阶段干物质、粗纤维、NDF 和ADF 降解速率均较上一阶段有所减缓，VFAs较小幅度的增加，松散连接菌群数量显著下降，紧密连接α多样性显著降低，厚壁菌门数量显著升高，未分类属菌群相对丰度升高，分类属菌群相对丰度降低，表明此阶段增加的未分类属的菌群依然主要属于厚壁菌门和拟杆菌门。

1.2 瘤胃中甲烷的产生途径

瘤胃中的甲烷主要以三条途径产生[7]（见图3）：

①以CO2作为底物的还原反应途径：饲草中的碳水化合物在酶解为结构简单的糖类后，经微生物的糖酵解反应，生成丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酸的过程中产生的CO2，与还原性甲基呋喃（NAD）结合消耗氢气，产生甲烷。反应过程如下：

②以挥发性脂肪酸（VFA）作为底物的分解反应途径：瘤胃中的VFA经过瘤胃内甲烷菌的一系列化学反应生成甲烷。反应过程如下：

这3 条途径中第一条途径为甲烷产生的主要途径。

2 农作物秸秆木质纤维素的预处理

农作物秸秆结构紧密，细胞壁的主要化学成分包括纤维素、半纤维素、木质素、果胶多糖、细胞壁蛋白等，共同构成了致密的紧密的网状结构，这种结构增加了细胞壁的机械强度，提高了对病毒的免疫能力，但同时也阻碍了反刍动物瘤胃水解酶与纤维素和半纤维素接触，降低了纤维多糖的利用效率。因此在农作物秸秆饲喂前常对其进行预处理，破坏其结构，将纤维素和半纤维素释放出来，并能够与酶进行良好的接触，提高其消化效率。农作物秸秆的预处理方法主要包括物理处理、化学处理、微生物处理。

2.1 物理处理方法

秸秆的物理处理方法主要包括铡短、粉碎、揉丝、制粒、汽爆、膨化等[8-9]，借助于机器，将秸秆铡短、粉碎、揉丝、制粒等可以减少家畜的咀嚼，提高其采食量，是生产中常见的处理方法，主要优点是便于操作，缺点是对秸秆的处理不够，并未破坏其内部结构，对秸秆消化利用率的提升有限。汽爆是将秸秆放入到高压密闭容器中，利用水蒸气渗透到秸秆内部，再瞬间释放压力，达到破坏秸秆内部纤维结构的目的，膨化处理是通过机械的剪切、摩擦、高温使秸秆变成糊状，通过狭小的模孔喷出后，秸秆膨胀冷却后变得酥脆蓬松，汽爆和膨化处理的优点是能够从秸秆内部破坏其纤维结构，提高秸秆的适口性和消化率，缺点是处理条件复杂且成本较高[10]。

2.2 化学处理方法

化学处理方法主要包括碱化处理、酸化处理、氨化处理等。秸秆在碱性化学物质的处理下半纤维素与木质素之间的酯键或醚键发生断裂，导致半纤维素的水解[11-12]。使用0.5%～1.0%的稀酸处理秸秆使其木质素和纤维素的结构发生变化，降低其强度，从而更容易被酶水解为单糖[13-14]。利用反刍动物可以利用非蛋白氮的特点，将氨基物质按照一定的比例喷洒到秸秆上，密闭氨化后，改变秸秆的纤维结构，软化秸秆，并产生糊香味，提高秸秆的适口性[8]。化学处理的优点是能够提高秸秆的适口性和营养基质的消化率，且成本较低，缺点是容易造成环境污染和动物中毒，应用范围窄[15]。

2.3 生物处理方法

生物处理方法主要包括微贮和酶解处理。秸秆微贮包括青贮和黄贮，是将收割的秸秆切碎后置于密闭容器中，经过好氧、发酵、稳定阶段后，制成具有酸香气味的微贮饲料，微贮的优点是制作简单，成本低，不受气候和季节的限制，因此秸秆微贮是秸秆饲料化最常用的方法[16-17]。酶制剂包括纤维素酶、半纤维素酶和多糖裂解酶等，由于酶直接饲喂会在瘤胃中快速降解以及成本高的原因，目前缺乏将酶直接饲喂的研究[18]，但研究发现瘤胃内甲烷菌和厌氧真菌共培养会表现出对纤维秸秆的强降解作用，Shi 等[19]用厌氧真菌F1（Pecoramycessp.）和产甲烷菌（M.thaueri）共培养处理蒸汽爆破玉米秸秆，可将木质纤维素基质转化为甲烷而无需任何处理，Li 等[20]用厌氧真菌F1（Pecoramycessp.）和产甲烷菌（M.thaueri）共培养发酵玉米秸秆的不同部位，表现出了对纤维素的强降解能力，因此厌氧真菌对纤维降解的能力的研究处在重要且高速发展的阶段，图4 为厌氧真菌在稻草秸秆上的发育阶段。厌氧真菌包含可以水解植物纤维素的全部酶系，主要包括GH 家族、CE 家族、碳水化合物酯酶和多糖裂解酶等，这些纤维素酶能够组装成多酶聚合体，也称为纤维小体[18]。由于厌氧真菌分离的困难及对发酵条件的严苛要求，因此厌氧真菌纤维降解酶基因的克隆及其在载体菌种的表达研究受到广泛关注，Ozkose 等[21]将从厌氧真菌Neocallimastixsp.中分离得到的纤维素分解酶基因构建的pCT 载体导入到乳酸菌IL403 和MG1363 中，并成功表达，将含有纤维素降解基因的乳酸菌作为青贮乳酸菌，显著降低了青贮饲料的酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维的含量。Ma 等[22]将从厌氧真菌Pecoramycessp.中获得的阿魏酸酯酶基因Fae13961和Fae16537在毕赤酵母（Pichia pastoris）中异源表达，其中Fae13961能够在不影响纤维素酶对纤维素降解的情况下与木聚糖酶协同作用，促进了木聚糖酶对木聚糖底物的降解。将厌氧真菌的纤维素酶导入到细菌中异源表达可以解决厌氧真菌培养条件严苛的问题，在秸秆饲料化利用上具有重要作用和意义。

图4 厌氧真菌Pecoromyces sp.F1在相差显微镜下的图片

3 瘤胃微生物活性及数量的提高改善农作物秸秆饲料的利用效率

瘤胃中存在大量的细菌、古细菌、真菌和原虫，其中瘤胃细菌有200 多种，含量为1010～1011个/g，厌氧真菌分为6 个属，含量为103～106个/g，所占比例较小，为20%左右[24]，原虫含量为104～106个/g，产甲烷菌含量为109个/g，与纤维降解相关的微生物占总的微生物组成的50%～75%[25]，通过分析瘤胃中细菌的高丝氨酸内脂（AHL）和AI2的AI-2信号基因的丰度和分布，表明瘤胃菌群之间通过基于AI-2的群体感应（QS）进行交流，共同组成了一个复杂的瘤胃菌群系统，降解和发酵膳食纤维素，为宿主提供能量和营养[26]。因此为了提高秸秆饲料的利用率，提高瘤胃细菌活性和数量是行之有效的方法。

提高瘤胃活细菌数量和活性的物质主要包括益生菌、蛋白酶、矿物盐、植物及其提取物以及其他化学物质等。益生菌被定义为能够以适当剂量对宿主动物产生有益影响的非致病无毒活微生物[27]。在饲料中添加或者直接灌服活酵母能够为乳酸菌提供有机酸和维生素刺激瘤胃乳酸菌的生长，乳酸菌通过稳定瘤胃pH 改善代谢，促进纤维分解菌的生长，活酵母还能够消耗瘤胃中的可用氧气为厌氧真菌提供合适的生长条件[28]。除酵母外，芽孢杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、瘤胃球菌等也常常被用于提高瘤胃微生物活性及数量[29-31]，这些益生菌进入瘤胃后，能够提高瘤胃内微生物粗蛋白含量、降低瘤胃中液氨浓度、提高VFAs 含量、降低瘤胃内的乙丙比、提高瘤胃内微生物丰度，特别是纤维降解菌丰度，有些益生菌还能够分泌细菌素，刺激免疫系统，抑制病原微生物的生长繁殖，调节动物肠道中的微生态平衡[32]。次级农产品包括果渣果皮、植物饼粕等，王艳萍等[33]在山羊日粮中添加不同比例的菠萝渣，显著提高了瘤胃中淀粉分解菌的数量，杨帆等[34]在肉牛日粮中加入发酵面包渣精料和发酵玉米皮精料，改善了肉牛瘤胃中蛋白及纤维降解类菌群丰度。酶制剂由于其在瘤胃中易被瘤胃微生物快速降解，因此常采用包被的形式饲喂给反刍动物，大量研究表明酶制剂能够显著改善瘤胃发酵能力，提高瘤胃微生物活性，Bowan等[35]研究发现，在泌乳奶牛日粮中补充酶，提高了消化道内纤维的消化。韩林等[36]在荷斯坦公牛日粮中添加5 g/d的纤维素酶，显著提高了瘤胃中α-淀粉酶及蛋白酶活性，改善了瘤胃发酵功能。矿物元素是反刍动物瘤胃中微生物不可或缺的营养物质，矿物元素缺乏会导致瘤胃对饲料的消化率降低、瘤胃微生物数量减少等，研究表明，在绵羊饲料中添加0.25%的硫酸钠可以显著提高瘤胃内细菌和真菌数量，提高瘤胃消化率[37]。硒在动物体内参与硒蛋白的合成，例如谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、甲状腺素脱碘酶（DIOs）等，在反刍动物日粮中添加硒可以提高反刍动物的抗氧化能力、免疫力以及瘤胃微生物丰度和饲料利用率等[38]。部分植物及其提取物也具有重要的提高反刍动物饲料消化率和瘤胃微生物数量和活性的物质，植物提取物是植物产生的次级代谢产物，是具有保护其免受采食者采食的生物活性物质，其中含有生物碱、黄酮类化合物、丹宁、树脂、萜类甾体和酚类化合物等[39]，郭晨阳[40]在泌乳荷斯坦奶牛日粮中添加质量比为1：1：1：1 的蒲公英、益母草、金银花和连翘的复合提取物0.3%，进行体外发酵试验表明，添加植物提取物后，对奶牛瘤胃微生物区系没有负面影响，且提高了纤维降解菌数量，瘤胃发酵类型趋于丙酸发酵。除上述几种物质外，其它一些物质也可以提高瘤胃消化能力，包括核黄素、胍基乙酸、蛋氨酸、甘油等[41-43]。

4 甲烷减排的主要调控措施及策略

为积极推进碳达峰碳中和，畜牧业也在积极谋求碳减排解决方案，反刍动物肠道发酵是甲烷排放的一个主要来源，甲烷作为温室气体其影响作用是CO2的25倍，而反刍动物消化道产生的甲烷占所有甲烷排放的16%[44-45]，因此低碳减排的关键在于甲烷。在瘤胃发酵过程中，除了产生氨气（NH3），还会产生甲烷（CH4）、二氧化碳（CO2）和甲基化合物（CH3—）以及乙酸盐（CH3COO—），这些副产物为甲烷古菌创造了一个生态位，即产甲烷古菌利用氢气还原二氧化碳或者甲基化合物而获得能量，同时降低瘤胃氢分压，使瘤胃发酵能够进行下去。瘤胃中硝酸盐/硫酸盐也可作为氢的电子受体，且更符合热力学定律，但是瘤胃中硝酸盐/硫酸盐含量较低，因此瘤胃中最主要的产甲烷途径为CO2/H2途径[46]，因此消除瘤胃中氢气或降低瘤胃中产甲烷菌活性在甲烷减排策略中具有重要作用。

4.1 饲料调控

通过改变饲料组成，是降低反刍动物消化道甲烷产生最简单经济的方法，主要方法是改变饲料类型或组成，调整饲料精粗比，饲喂粗纤维含量较低的饲料，瘤胃发酵更趋向于丙酸型，由于丙酸也是氢气的电子受体，因此瘤胃中丙酸盐的增加导致用于产生甲烷的氢气的减少，降低瘤胃甲烷的产生[47]。

4.2 饲料添加剂

在反刍动物日粮中添加有机物或无机物特异性地抑制产甲烷菌或者改变瘤胃代谢途径能够达到降低瘤胃甲烷产量的作用，这些物质主要包括离子载体、产甲烷抑制剂、植物精油和其他植物提取物、有机添加剂等[45]，市售的离子载体包括莫能菌素（Rumensin）、拉沙洛西（Bovatec）、盐霉素（Bio-cox、Sacox）和赖氨霉素（Cattlyst）等，据报道它们能够改变瘤胃乙丙比，降低瘤胃中蛋白质的降解，提高了流入小肠中蛋白质的含量，离子载体还作为抗菌剂，能够破坏特定微生物膜上的离子浓度梯度（Ca2+、K+、H+、Na+），能够优先抑制产生乳酸、乙酸、丁酸、甲酸和氢作为最终产物的革兰氏阳性菌，从而降低产甲烷菌的甲烷产量[48]。甲基辅酶M 还原酶（McR）催化甲烷代谢的最后一步，包括辅酶M（HS-CoM 或2-巯基乙磺酸）的甲基转移反应，辅酶M 是含有镍的电子供体辅酶F430（活性：Ni+或非活性：Ni2+），在该过程中还原释放甲烷的底物甲基辅酶M[49-50]，因此破坏这一过程对减少甲烷排放具有重要意义，主要包括卤代磺酸化合物、氯仿、硝基衍生物等。植物精油是从植物材料中提取的挥发性芳香油性液体，其主要作用是利用不饱和脂肪酸的氢化作用消耗氢，限制产甲烷菌对氢气的利用[51]，此外皂苷、类黄酮、单宁和其他萜类化合物也具有重要的甲烷抑制作用[52]。

4.3 益生菌制剂

益生菌添加剂被认为具有通过促进丙酸生成、乙酰乙酸生成、硝酸盐/亚硝酸盐或硫酸盐还原来与产甲烷菌竞争氢气供应[53]，其中硝酸盐/亚硝酸盐还原菌、硫酸盐还原菌、甲基营养菌直接与二氧化碳竞争氢气，而减少甲烷排放，而酵母菌、丙酸生成菌、纤维降解菌等则是降低瘤胃乙丙比而减少甲烷排放，产抑菌物质细菌则是从抑制甲烷细菌活性而抑制甲烷产生，特别是乳酸菌产生的细菌素对甲烷减排均有重要作用，例如体外试验中乳酸链球菌产生的链球菌素可降低甲烷排放达到20%，而对VFAs的产生没有显著影响[54]。

5 小结与展望

我国每年产生大量的饲料秸秆，其中大量秸秆未被利用，造成了环境的污染和资源的浪费，而我国目前又处于饲料的严重短缺阶段，每年需要进口大量饲料，而秸秆可以被反刍动物瘤胃消化利用，因此秸秆饲料化是处理目前秸秆及饲料问题的最佳选择，秸秆由于其特殊结构，消化利用率不高，因此了解农作物秸秆在瘤胃中降解的时空程序、甲烷在瘤胃中的来源、提高农作物秸秆利用率的方式、以及甲烷减排策略可以为秸秆饲料化利用提供一些启发。